Transcript Fundamentos de los AIRQ

Fundamentos de los
Análisis
Inmunoradioquímicos
(AIRQ)
Dra. Patricia Oliver
Área Radiofarmacia
CIN - Facultad de Ciencias
Análisis basados en reacción Ag-Ac o
ligando-receptor
Clasificación
REACTIVO ESPECIFICO
TRAZADOR
Radionucleido
Anticuerpo
RIA
Receptor
RRA
IRMA
Enzima
EIA
Cromógeno
LIA
Quimioluminiscencia
QIA
ERA
Análisis inmunoradioquímicos
Técnicas
analíticas
cuantitativas
o
semicuantitativas de amplia aplicación en
medicina, veterinaria, así como en I&D.
Son utilizadas para dosificar o detectar
sustancias
(analitos)
presentes
en
pequeñas concentraciones en distintos
fluídos biológicos u otras muestras.
Análisis inmunoradioquímicos
Tipos
RIA
Radioinmunoanálisis
Ac + Ag + Ag*  Ac-Ag + Ac-Ag* + Ag + Ag*
IRMA
Análisis inmunoradiométrico
FS-Ac + Ag + Ac’* FS-Ac-Ag-Ac’*
RRA
Análisis de radio-receptor
R + L + L*  R-L + R-L* + L + L*
RIA
Método en el que el analito (Ag no
marcado) presente en cantidad variable y
el radiotrazador (Ag* marcado) presente
en cantidad fija compiten por los sitios de
unión del anticuerpo que se halla en
cantidad limitada
RIA
Ag + Ac  AgAc
Ag + Ac  AgAc + Ag
Ag*+ Ac  Ag*Ac + Ag*
Respuesta inversamente proporcional a [Ag]
RIA de digoxina
Curva estándar
RIA
Equilibrio antígeno- anticuerpo
RIA
El antígeno marcado compite con el antígeno frío por
su unión al anticuerpo limitado
RIA
Ausencia de antígeno da la unión máxima
RIA
Unión no específica del trazador al medio de reacción
Ventajas del RIA
• Alta especificidad
• Alta sensibilidad 10-9 - 10-12g
• Manipulación sencilla
• Detección simple
• Volumen muestra
10-100 mL
Desventajas del RIA
• Posibilidad de reacción cruzada
• Pérdida de inmunoreactividad
por daño por marcación
Componentes
•Trazador
•Anticuerpo
•Estándar
•Separación
Trazador
• Pureza elevada
• Inmunoreactividad
• Actividad específica alta
125I, 3H
• Radionucleidos
125I

T1/2
60 días

Eg
35 keV

Eff conteo 70 %
125I-Ag
Desventajas
•Modificación química para esteroides
•Estabilidad no mayor de 60 d
•Precauciones por radiación g
125I-Ag
Métodos de marcación
• Cloramina-T
• Lactoperoxidasa
• Bolton-Hunter
• Iodogen
Componentes
•Trazador
•Anticuerpo
•Estándar
•Separación
Anticuerpo
•Determina
Sensibilidad
Especificidad
Precisión
Anticuerpo
Anticuerpo
• Características
Título
Afinidad
Reacción cruzada
Título
•Dilución del anticuerpo que se satura
con el 50% del trazador
Dilución óptima: es la que da la mejor
relación entre estándar alto, medio y
bajo
Afinidad
k1
Ag + Ac  AgAc
k2
v1= k1[Ag] [Ac]
v2= k2[AgAc]
En el equilibrio v1= v2 entonces
Ka=k1/k2= [AgAc]/[Ag] [Ac]
Ka ~ 1010 - 1013 M-1
Especificidad
1. Progesterona
2. 17b Estradiol
3. Pregnanodiol
4. Cortisol
5. 11-deoxicortisol
6. Testosterona
7. Pregnenolona
8. Corticosterona
9. 17a-OH-progesterona
10. 11-OH-progesterona
11. 11-deoxicorticosterona
12. 5b-pregnan-3,20-diona
13. 11a-OH-progesterona
14. 5a-pregnan-3,20-diona
Componentes
•Trazador
•Anticuerpo
•Estándar
•Separación
Estándar
• Niveles de concentración del
analito exactamente conocidos
• Matriz análoga a las muestras
• Procesamiento idéntico a las
muestras problema
• Determina la exactitud del RIA
Obtención del estándar
• Síntesis
• Extracción a partir de órganos o
tejidos
• Ingeniería genética
• Calibración con estándares de
referencia internacional
Requerimientos del estándar
•
•
•
•
•
Identidad con el analito
Reproducibilidad
Estabilidad
Pureza elevada
Especie molecular única o libre de
interferencias
Componentes
•Trazador
•Anticuerpo
•Estándar
•Separación
Método de separación
•Rápido
•Sencillo
•Económico
•Reproducible
•No alterar equilibrio
Clasificación
•Adsorción
•Precipitación
•Fase sólida
Adsorción
•Carbón activado (Norit A)
•Carbón - dextrano
•Resinas intercambio iónico
•Silicatos
Medición de AgAc en el sobrenadante
Precipitación
• 2º Anticuerpo (antigamaglobulina)
•Sulfato de amonio
•Solventes orgánicos (EtOH, PEG)
•TCA
•Proteína A
Medición de AgAc en el precipitado
Fase sólida
El anticuerpo o ligando está unido a un polímero
insoluble
No requieren centrifugación
• Esferas de sephadex o látex
• Partículas magnéticas
• Discos de celulosa
• Pared del tubo
Procesamiento de datos
• Gráficos
• Métodos de ajuste
Representaciones gráficas
Lineal
30
%B/T
25
20
Logit - log
15
10
4
0
0
100
200
300
400
500
FSH (ng/mL)
Logarítmica
ln (Y/(1-Y)) Y=B/Bo
5
3
2
1
0
-1 1
10
100
-2
-3
-4
30
FSH (ng/mL)
25
%B/T
20
15
10
5
0
1
10
100
FSH (ng/m L)
1000
1000
Métodos de ajuste
• Interpolación lineal
y = a+bx
• Interpolación spline
• Regresión lineal
• Regresión polinomial
• Ecuación logística
y = a+bx+cx2+dx3
y = a+bx
y = a+bx+cx2+dx3
y=
(a-d) + d
1+(x/c)b
y = (a-d) + d
[1+(x/c)b]m
y=respuesta, a=Bo, b=pendiente, c=ED50,
d=NSB, x= conc., m=factor de asimetría
IRMA
Relación
directa
entre
la
concentración del analito a
cuantificar y la respuesta del
sistema analítico.
IRMA
Actividad unida a la fase sólida es
la fracción unida del sistema.
Actividad unida al complejo
representa la relación directa con
la concentración del analito a
cuantificar.
IRMA
Anticuerpos monoclonales
Introducción de plásticos con
propiedades
adherentes
de
inmunoglobulinas o moléculas
grandes
IRMA
Técnica Sandwich
IRMA
Técnica Sandwich
IRMA
Técnica Sandwich
IRMA
Técnica Sandwich
IRMA
Técnica Sandwich
IRMA
Técnica Sandwich
IRMA
Comparación con RIA
• Unión de todo el analito presente
• Sensibilidad teóricamente infinita
• Especificidad: analito reconocido por dos paratopos
• Reproducibilidad (tecnología en fase sólida) ~ al RIA
• Limitación en el caso de moléculas pequeñas que
pueden no disponer de diferentes paratopos que puedan
ser reconocidos por diferentes anticuerpos
IRMA
El empleo de exceso de
anticuerpo acelera las reacciones
y se alcanza el equilibrio en
menos tiempo
Control de calidad
• Credibilidad al sistema analítico
• Credibilidad de cada etapa involucrada directa
o indirectamente con el sistema analítico
• Proceso por el cual el laboratorio observa sus
propios análisis
Control de calidad
Interno
Inspecciones internas
Sueros control bajo, medio y alto
Externo
Credibilidad y Acreditación
RRA
Basado en la inhibición competitiva de la
unión del analito radiomarcado (L*) a su
receptor específico por parte del analito
frío (L) u otras sustancias motivo de
análisis.
RRA
Dependen de la detección de unión activa
entre un ligando a su receptor específico,
el cual puede ser agonista o antagonista.
Esta reacción va a depender de la
concentración de radioligando usada al ser
esta una reacción de unión bimolecular.
Componentes del RRA
• Analito frío
• Analito radiomarcado (con 125I)
• Receptor específico
• Método de separación
Unión específica vs Unión
inespecífica
• La unión específica es saturable, por lo
que al graficarla se observa una meseta a
concentraciones crecientes de L* (los
RPTs son siempre saturables)
• La unión no específica no es saturable
mostrando entonces una relación lineal a
concentraciones crecientes de L*
Unión específica vs Unión
inespecífica