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TECNICAS
INMUNOENZIMATICAS
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Se utilizan ENZIMAS como
marcadores inmunoquímicos, que
permiten detectar las uniones
primarias antigeno-anticuerpo.
Las enzimas son moléculas estables,
económicas.
Son fácilmente conjugables con
anticuerpos o con antígenos.
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Actúan como un sistema indicador de
la presencia de inmunocomplejos al
combinarse con sustratos de diversos
tipos: cromogénicos.
El producto de la reacción enzimática
da lugar a una emisión de color,
fluoresencia o quimioluminisencia.
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La intensidad de la coloración o de la
inmunofluoresencia es proporcional a
la cantidad de elemento analizado
presente en la muestra.
TECNICA DE ELISA
ENZYMED LINKED
INMUNOSORBENT ASSAY
HISTORIA
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1966 Avrameas y Uriel concibieron la
idea de marcar antígenos y
anticuerpos con enzimas.
1966 Nekane, Pierce conjugaron
enzimaticamente anticuerpos para
localizar antígenos víricos en cortes de
tejidos de animales.
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1971, Engvall y Perlmann describieron
el primer método de ELISA, como
alternativa al radioinmunoanalisis
(RIA), para titular inmunoglobulinas.
1974, Voller utilizó el método de la
microplaca y sugirió su uso para
cuantificar anticuerpos inducidos por
enfermedades infecciosas.
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1985, PRIMER KIT COMERCIAL PARA
DETECTAR LA ENFERMEDAD DE
AUJESZKY.
PRUEBA INMUNOSORBENTE
LIGADA A ENZIMAS
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Prueba de UNION PRIMARIA
Se puede utilizar para detectar y
cuantificar los inmunocomplejos
mediante un marcador enzimático que
actúa con un sustrato cromogénico
adecuado.
Se puede detectar antígeno.
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El grado de transformación del
sustrato incoloro a un producto
coloreado se cuantifica objetivamente
por espectrofotometría y es
proporcional a la cantidad de
inmunocomplejos formados.
VENTAJAS
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Método sensible.
Bajo costo.
Fácil manejo.
Permite desarrollar un gran número de
muestras en un corto período de
tiempo.
Buen equilibrio entre sensibilidad y
especificidad.
ETAPAS DE LA TECNICA
ELISA
MUESTRA CON
ANTICUERPO
O
ANTIGENO
FOSITO
TAPIZADO
CON ANTIGENO
O
ANTICUERPO
CONJUGADO DE
AG O AC
CON ENZIMA
INCUBACION
LAVAR
FOSITO
TAPIZADO
CON ANTIGENO
O
ANTICUERPO
S
U
S
T
R
A
T
O
I
N
C
U
B
A
R
FOSITO
TAPIZADO
CON ANTIGENO
O
ANTICUERPO Y
CONJUGADO
LAVAR
FOSITO
TAPIZADO
CON ANTIGENO
O
ANTICUERPO Y
CONJUGADO
FOSITO
TAPIZADO
CON ANTIGENO
O
ANTICUERPO Y
CONJUGADO
COLOREADO
COMPONENTES DEL KIT
DE ELISA
SOL.
DILUYENTE
SOL.
STOP
PLACA
CON
FOSITOS
SOL.
SUBSTRATO
CONTROLES
CONJUGADO
MATERIALES Y EQUIPO
PUNTAS DESCARTABLES
MICROPIPETAS
ESPECTROFOTOMETRO
RECOMENDACIONES
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ANTES DE INICIAR LA PRUEBA…
Trabajar en áreas que estén a 2025°C.
Alejadas de aire acondicionado o
corrientes de aire.
Tener el inserto de la prueba a la
mano.
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Que todos los componentes del KIT
alcancen una temperatura ambiente por lo
menos 2 a 3 horas antes de iniciar la
prueba.
Homogenizar antes de utilizarlos !!!
Tener en cuenta el número total de
muestras a analizar.
Llenar una hoja de resultados y control con
la posición de las muestras en la placa de
poliestireno.
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Realizar los cálculos previos de solución de
lavado a preparar.
Tener el equipo necesario listo y en buen
estado (puntas de micropipetas,
micropipetas adecuadas, material de
laboratorio)
El agua para reconstituir la solución de
lavado concentrada debe ser destilada y
estéril.
Que la solución de lavado no presente
cristales de precipitación.
RECOMENDACIONES
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MANTENER UN CONTROL ESTRICTO
DEL TIEMPO EN CADA INCUBACIÓN Y
RESPETARLO!!!!
Colocar la cantidad exacta de reactivo
y muestra a analizar.
No deben haber burbujas de aire en
las puntas ni en los fositos de la placa.
MUESTRAS A ANALIZAR
SUERO
LECHE
MUESTRAS
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No utilizar muestras de sangre
hemolizadas o lipemicas.
Se deben mantener de 2 a 4 °C no
mas de 3 a 5 días.
Se pueden mantener durante periodos
prolongados si se trasvasa el suero y
se almacena a temperatura de
congelacion o a -20 °C.
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Se deben utilizar a temperatura
ambiente.
Se deben homogenizar utilizando el
vortex o manualmente por lo menos 5
veces.
MODO CORRECTO DE
UTILIZAR LA MICROPIPETA
TIPOS
INDIRECTO
DIRECTO
ELISA TIPO SANDWICH O DE
CAPTURA DE ANTIGENO
DOT ELISA
INDIRECTO DETECCION DE
DE ANTICUERPOS
COMPETITIVO
ELISA INDIRECTO
DETECCION DE
ANTICUERPOS
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La reacción se lleva a cabo en los
fositos de la placa, donde se adsorbe
el antigeno conocido, con el suero
problema.
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La actividad enzimática sobre el sustrato
apropiado, añadido al final de la reacción,
se revela por cambio de color cuantificable
por espectrofotometría, la intensidad es
proporcional a la cantidad de
antiinmunoglobulina marcada captada, que
a su vez es proporcional a la cantidad de
anticuerpos presentes en el suero problema.
ELISA COMPETITIVO
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Puede utilizarse para la determinación
de anticuerpos o de antigenos.
ANTICUERPOS
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Se establece una competencia entre
los anticuerpos del suero problema y
UN ANTICUERPO SECUNDARIO
(conjugado).
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La muestra se incuba con el antigeno
conocido para la formación de los
inmunocomplejos.
Luego se agrega el conjugado que
contiene un anticuerpo especifico
secundario MARCADO
ENZIMATICAMENTE.
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Este anticuerpo se unirá a el antigeno
libre del fosito. (SUEROS NEGATIVOS)
Esta reacción es la que se colorea.
POR LO TANTO LAS MUESTRAS
POSITIVAS NO TOMAN NINGUN
COLOR PORQUE LA ENZIMA NO SE
LIGA AL COMPLEJO ANTIGENO
ANTICUERPO QUE SE FORMÓ.
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Cuanta mas inmunoglobulina haya en
la muestra menos antigeno habrá
quedado disponible para unirse a los
anticuerpos secundarios.
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La adición del anticuerpo marcado
especifico y su reacción con el sustrato
revela la existencia o no de antigeno
libre, en una relación inversamente
proporcional a la cantidad de
anticuerpos presente en la muestra.
ELISA DIRECTO
CAPTURA DE ANTIGENO
SANDWICH
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En la placa de poliestireno se encuentra el
anticuerpo especifico para detectar el
antigeno en la muestra.
La solución de conjugado contiene la
enzima ligada con un segundo anticuerpo
especifico conocido que se une por otro
epitopo al antigeno.
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El antigeno queda capturado en una
especie de SANDWICH.
El cambio de color al agregar el
sustrato demostrara la presencia del
antigeno.
La intensidad de la reacción cromática
se relaciona directamente con la
cantidad de antigeno.
DOT ELISA
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El complejo antigeno anticuerpo se
visualiza como PUNTOS (DOT) de
color sobre una membrana de
nitrocelulosa.
Es una técnica cualitativa.
Es sencillo.
No necesita de equipo de lectura.
Pueden ser directas o indirectas.
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Posee controles positivos y negativos.
Es de un solo paso.
Se puede utilizar diferentes muestras
para el análisis.