Transcript Molecular biology technique (I) Southern/Northern

Western blotting,
inmunoblotting o SDS-PAGE
Tecnica para detectar proteinas
especificas separadas por electroforesis
utilizando anticuerpos marcados.
Secuencia del Western blot
Electroforesis de la muestra con las proteinas
Transferir las proteinas desde el gel a membrana de nitrocelulosa
Coloracion de las proteinas para confirmar transferencia
Bloqueo de los sitios de union inespecificos remanentes en la
membrana de nitrocelulosa
Incubacion con el anticuerpo especifico primario
Lavados del anticuerpo no unido
Deteccion del anticuerpo unido utilizando anticuerpos conjugados
a perroxidasa de rabano picante (HRP)
Revelado con sustrato quimioluminiscente y deteccion con placas
radiograficas
Secuencia del Western blot – Paso 1
Paso 1
Electroforesis de las muestras de proteínas:
-Las proteínas se desnaturalizan con calor, SDS y sustancias como
beta mercaptoetanol o ditiotreitol que rompen puentes -S-S-El SDS aporta cargas negativas
-Las proteínas corren hacia el ánodo (+) y se distribuyen en el gel
Fuente de poder
de acuerdo a su peso molecular
Muestra de proteínas
para cargar en el gel
Proteínas ya corriendo
en el gel
Secuencia del Western blot – Paso 2
Paso 2 - Transferencia a la membrana de nitrocelulosa:
-Las proteínas separadas por tamaño se transfieren desde el gel a una membrana de nitrocelulosa
-Otra vez se aprovecha la carga negativa de las proteínas
Se detiene la corrida electroforetica
Se quitan las burbujas para asegurar
la correcta transferencia
Se desarma con cuidado la cuba electroforetica para liberar
el gel con las proteinas separadas por masa
Armado del cassette de transferencia
El gel con las proteínas se coloca en el cassette de transferencia
Cassette listo para iniciar transferencia
Paso 3
Incubación con anticuerpos específicos y revelado:
Proteína sobre la membrana
Bloqueo de los sitios no ocupados en la
membrana con proteína inerte (ej.
Albúmina)
Incubar con anticuerpo primario
Incubar con anticuerpo secundario
marcado con HRP
Incubar con sustrato especifico
Revelado quimioluminiscente
Proteína de interes se ve como una banda
oscura
Paso 4
Revelado y análisis:
Fundamento de la tecnica de revelado quimioluminiscente
-El anticuerpo secundario esta
marcado con HRP (peroxidasa)
que en presencia de agua
oxigenada degrada el luminol
con emisión de luz
-La emisión de luz (fotones)
se revela en oscuridad
sobre una placa radiográfica
sensible a la luz
-Las bandas se obtienen en el film
en la misma posición donde
se encontraba la proteína
-Alta sensibilidad
Existen otras tecnicas de revelado de WB
sustrato
enzima
H2O2
producto
coloreado
quimioLum
Obs
luminol
HRP
si
no
si
muy sensible
3,3´diaminobencidina
HRP
si
marrón
no
toxico
DAB+niquel
HRP
si
negro
no
toxico, mas
sensible que
DAB
3,3´,5, 5´
tetrametilbencidina
HRP
si
azul
no
producto
semisoluble
4 cloro naftol
HRP
si
azul-negro
no
poco
sensible
Bromocloroindolil
fostato +NBT
FAL
no
azul
no
reaccion
lenta y
progresiva
Naftol-AS-MX fosfato
+ Fast red
FAL
no
rojo
no
poco
sensible
AP/misty purple
FAL
no
purpura
no
muy estable
HRP = peroxidasa / FAL = fosfatasa alcalina
Utilizacion de WB en la clinica:
Confirmacion de diagnostico de HIV
env
gp160
gp120
gp 41
-Se corren proteínas de HIV
-Se transfieren a nitrocelulosa
gag
pol
p55
p18
p24
-Se incuba la membrana con suero
del paciente
-Se revela con anticuerpos secundarios
p65
p51
p31
Commercial Methods in Clinical Microbiology. 2000. ASM Press.
Utilizacion de WB en la clinica:
Confirmacion de diagnostico de HIV
Criterio de la OMS:
env
gp160
gp120
gp 41
gag
p55
p18
p24
pol
p65
p51
p31
-Negativo: Ninguna banda presente
-Positivo: Dos bandas ENV presentes
-Indeterminado: Cualquier banda que no alcance criterio
de positividad
Utilizacion de WB en la clinica:
Confirmacion de diagnostico de HIV
Seroconversion de un paciente
gp160/120
p66
p55/51
gp41
p32
p24
p17