Transcript Replication initiator DnaA interacts with an anti

Replication initiator DnaA interacts with an
anti-terminator NusG in T. tengcongensis
Jingfang Liu a,b, Huadong Pei a,c, Shuangshuang Mei a,b, Jie Li a,b, Ligang Zhou a,b, Hua
Xiang
Ana Laura López López
Dna A
• Proteína implicada en el inicio de la
replicación del DNA
• Estructural y funcionalmente similar
al complejo de reconocimiento del
origen (ORC) en eucariotas.
• Durante el inicio de la replicación en
E.Coli interacciona consigo misma,
además
de
interaccionar
con
proteínas
replisomales
(DnaB,
Complejo
Clam/Clam
de
la
polimerasa III en cooperación con la
proteína Hda).
Nus G
• Proteína esencial, participa en
procesos de transcripción y
traducción
como
antiterminador y terminador.
• Mejora la eficiencia de Rho
mediando
la
terminación
transcripcional,
al
mismo
tiempo es un antiterminador
que acelera el crecimiento de
cadenas de RNA por acción de
la RNA pol (RANP)
Objetivo
• Demostrar que TtDnaA y TtNusGs de T. tengcongensis
interactúan tanto in vitro como in vivo en procesos de
replicación de ADN.
Plásmidos utilizados en este estudio
Oligonucleótidos utilizados en este estudio
Experimento de doble hibrido
PCR
Amplificación de los genes de TtDnaA y Nus G
Los productos fueron cortados con enzimas de
restricción y clonados en pGADT7 y pGBDT7
Para generar plásmidos de fusión que contenía el
domino activo (AD) y el dominio de unión (BD)
Así podían meter los plásmidos a la levadura y producir cada uno de los
fragmentos proteicos por separado o en las combinaciones que querían
Se determinó la actividad transcripcional mediante la cuantificación del gen
reportero (X-Gal)
Resultados
Análisis de la interacción entre los híbridos de levadura TtDnaA y TtNusG2
de T. Tengcongensis.
Resonancia de superficie de plásmidos
Co-inmunoprecipitación entre la TtDnaA nativa y TtNus G2 en vivo.
Los extractos celulares totales y el precipitado de muestras sin anticuerpos fueron
los controles positivo y negativo
Determinación de la región de DnaA que interacciona con NusG2
CONCLUSIONES
La proteína NusG2 interacciona con la proteína DnaA
tanto in vivo como in vitro
Es posible que NusG2 participe en la regulación de la
replicación del cromosoma (inicio) por que regula la
expresión DnaA a través de la interacción con la caja
DnaA al inicio del promotor, lo que acelera la actividad
de la RNApol.
los niveles de proteína DnaA que será utilizada para
la replicación
Escogemos el Vector: plásmidos
comerciales
Insertamos el gen de la proteína en la sitio
de clonaje.
La proteína de fusión será precedida de la
la ß-galactosidasa (lacZ).
El plásmido así transformado se introduce
en una bacteria o levadura a la que se le ha
suprimido el gen lacZ.
Vector