Transcript Replicación del DNA

Replicación del DNA
Dogma Central
replicación
transcripción
DNA
traducción
RNA
Transcripción
inversa
proteina
Cromosomas Procariontes
Cromosoma lineal eucarionte
Características Generales de la Replicación




Semi-conservativa
Bidireccional
Semi-continua ó semi-discontinua
Alta fidelidad
Replicación semiconservativa
Replicación bidireccional
7
Replicación semidiscontinua
la polimerización se lleva
a cabo en dirección 5´--3´
Replicación del DNA y ciclo celular
Etapas de la Replicación
I. Inicio: es el punto en
donde se regula el proceso
II. Elongación
III.Terminación
I. Inicio de la replicación
Ori C
Secuencia rica en T-A
Minicromosomas para determinar el origen mínimo
E. coli
DNA cromosomal (E. coli) + Enzima de restricción
DNA plasmídico + Enzima de restricción
origen
+
+
R
R
mezclado
Transformar
bacterias
Medio con antibiótico
ligasa
X DNA
NO se replica
Ori-coli
Medio con antibiótico
R
Se replica
Metodo de footprinting para determinar el sitio de origen de la
replicación
Dna A reconoce el sitio de inicio de la replicación
1)
2)
3)
4)
Nucleasa + DNA Ori
Dna A + DNA Ori
DnaB + DNA Ori
DnaC + DNA Ori
1
245
1
2
3
4
Secuencia del origen de Replicación bacteriano
Región de los treceámeros (tres
repeticiones de 13 nucleótidos),
70% AT
5 Nonámeros o cajas DnaA
once sitios GATC en la secuencia de 245pb
Organización del OriC
R1=R4>R2>R3=R5
DUE: DNA unwinding element
IHF: Integration host factor
FIS factor
DnaA
DiaA: DnaA initiator-associating protein
IHF: Integration Host factor
1) Activación 20-30
DnaA
Arginina 285 es
importante en la oligomerización
Proteína DnaA
• Monómero 52kDa
• Se une con alta afinidad y de forma cooperativa a las cajas
dnaA
• Estequiometria de hasta 20-30 subunidades de DnaA por oriC
• Une ATP y lo hidroliza a una velocidad muy baja
• Una vez abiertos los treceámeros, DnaA reconoce las cajas
presentes en el DUE y se une a la cadena sencilla
estabilizandola.
Regulación negativa del inicio de la replicación
1) Hda (RIDA: regulatory inactivation of DnaA)
2) dat locus (DnaA titulación): sitio en el cromosoma que une
grandes cantidades de proteína DnaA
Aproximadamente 200-300 moléculas
de DnaA pueden unirse al locus dat.
El locus dat (1kb) contiene 5 cajas DnaA
y un sitio para IHF
DDAH: dat dependent DnaA-ATP hydrolisis
3) Interacción de OriC con SeqA y la membrana
Regulacion de la expresión de DnaA
Regulación de DnaA
Promotor de DnaA tiene cajas DnaA y secuencias
GATC.
Reactivación de DnaA-ADP a DnaA-ATP
DARS: DnaA reactivation sequence: sitios en el cromosoma que contienen cajas DnaA
en orientaciones diferentes
DiaA: DnaA initiator-associating protein
IHF: Integration Host factor
1) Activación 20-30
DnaA
2. Formación del
pre-primosoma
HELICASA DnaB
C-terminal ATPasa
Se mueve en dirección
5´---3´
DnaB
• Monómeros de 60kDa que
forman un homohexámero
• Actividad de helicasa
• Dominios para :
 Unión a DNA de cadena
doble
 Unión a DNA cadena sencilla
 Interacción con DnaC y DnaA
 Hidrólisis de NTPs (ATP)
Dna C
• Monómeros de 28 kDa
• Homohexámero que permite
la llegada de DnaB
• ATPasa: al hidrolizar ATP
pierde afinidad por DnaB
Pre-primosoma y primosoma
II. Elongación
La replicación del DNA requiere un cebador
catalizado por la DNA Primasa
• Dna G, Primasa, ≈ 60 kDa
• RNA polimerasa
• Sintetiza cebador de ≈ 12nt
• DNA Primasa reconoce a
DnaB
Proteínas de unión a cadena sencilla: SSB
Las proteínas SSB se unen con alta
afinidad al DNA de cadena sencilla y lo
protegen de nucleasas y de asociaciones
intracatenarias
DNA polimerasas de bacterias
Reacción de polimerización
DNA polimerasas en E. coli
Características de la DNA polimerasa I
Actividades de la DNA polimerasa I
• Mutantes de E.coli en el gen de la Pol I son “viables”, por lo
tanto la DNA polI no es la principal enzima replicativa (pero no
soportan deleciones del gen).
• Mutantes de DNA pol II son viables, aún con el gen deletado.
• La DNApolIII es la principal enzima en la replicación del DNA.
Las mutaciones son letales.
• Fidelidad se refiere al seguimiento exacto de la secuencia
de DNA que sirve como molde
• La fidelidad de la replicación en bacterias: ≈10-8 a 10-10
• Procesividad # de nucleótidos que se sintetizan en un
solo evento de unión. Una enzima procesiva agrega miles.
Por qué no existe una DNA polimerasa 3´--5´?
DNA polimerasa
III holoenzima
an asymmetric dimer
Subunidades de la DNA polimerasa III de E.coli
sub
# por
holoenzima
Mr
Función
dnaE
α
2
132,000
Subunidad
dnaQ
ε
2
27,000
Proofreading
holE
θ
2
10,000
Acoplador
dnaX

2
71,000
Dimerización
dnaX

1
48,000
holA
δ
1
35,000
holB
δ´
1
33,000
holC
χ
1
15,000
holD
ψ
1
12,000
dnaN
β
4
37,000
Pol III
Núcleo
10-15
catalítica
nuc/seg
Abrazadera que
carga las
subunidades β al
DNA
Complejo  ó
complejo 
Procesividad
Pol III’
Pol III*
Pol III holo
1,000 bases/seg
Procesividad de la polimerasa III
La procesividad de la DNApol lII* aumenta de
50 nts a más de 50,000 nts gracias a la
subunidad β
Modelo del dímero
Cuál es la participación de las DNA polimerasas
en la replicación?
Maduración de los fragmentos de Okazaki
DNA polimerasa I ayuda a remover el
cebador con su actividad de exonucleasa 5´3´ Actividad de polimerasa reemplaza los
nucleótidos eliminados ≈17
DNA ligasa cataliza la
formación de enlace
fosfodiéster
DNA ligasa
DNA topoisomerasas
Topoisomerasas en
E. coli
Topoisomerasa I
IA. 5´
TOPOISOMERASAS I
Topoisomerasa III
IB 3´
TOPOISOMERASAS II
IIA.
IIB
Topoisomerasa II
(DNA Girasa)
Topoisomerasa IV
III. Termino de la replicación
ORIGEN DE REPLICACION EUCARIONTE
Solo uno o múltiples?
Tiempo de replicación/tamaño de genoma
Múltiples orígenes?/Orígenes diferenciales?
Encendido durante el ciclo
Existe una secuencia única?
Experimentos con plásmidos
Levaduras vs eucariotes superiores
Replicación una vez por ciclo?
Depende del ciclo celular?
Inicio de la replicación en eucariotes
Mas de 10 kpb
En S. cerevisiae en promedio
cada 30,000. En mamíferos
se encuentran entre 100,000 a
250,000.
La tasa de replicación es
aprox. 2000bp/min.
No todos los orígenes se activan al mismo tiempo
Eucromatina se duplica primero, heterocromatina al final
Ensayos para identificar secuencias que actúen como orígenes
Inicio de la replicación en eucariontes
:Saccharomyces cerevisiae
ARS: Autonomously replicating sequence
ATTTAATATTTTGGA
% of origin function
Mutaciones en A abaten la función.
En B sólo se reduce
ARS
Proteínas ORC
Origin recognition complex (ORC)
complejo que se une a A y B1
Se encuentra unido durante todo
el ciclo celular
ORC
1-6
Cdc6
Cdt1
ORC
1-6
Orc 6 es estructuralmente relacionada a TFIIB
Estructura y formación de la helicasa Mcm2-7
Traslocación 3´--5´
Pre-RC
“licencia para replicar”
Activación:
eventos de
fosforilación
Complejo CMG: Cdc45-Mcm-GINS
a través de Sld2 y Sld3
Iniciación
Complejo CMG
GINS
Psf1
Psf2
Psf3
Sld5
+ Cdc45+ MCM2-7
CMG
Incrementan la actividad de la helicasa al inicio para abrir las cadenas y
permanecen a lo largo de la elongación
Control del inicio de la replicación
a lo largo del ciclo celular
Cdt1 y geminina limitan la replicación del DNA
PCNA
(Helicasa)
(PCNA-like)
MCM8 (primasa)
Pol -cadena lagging
Pol -cadena líder
Proliferating Cell Nuclear Antigen
PCNA
Proteína 29kDa
Incrementa procesividad
de la DNA polimerasa
Forma un homotrímero
alrededor del DNA
RFC: “ clamp loader” de PCNA
Polimerasas de eucariotes
Horquilla de la Replicación Eucarionte
Procesamiento de los fragmentos de Okazaki
Terminación en eucariontes:
El dilema de los cromosomas lineales
Telomerasa
Telomerasa
GGTTAG
T-loop