Transcript Wykład prof. A. Ejcharta

Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Metody NMR stosowane w badaniach
biopolimerów
Część 4:
Badania strukturalne oligosacharydów
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Zastosowanie spektroskopii NMR
w badaniach oligosacharydów.
 Podstawowe definicje
 Budowa monosacharydów
 Struktura pierścieniowa i mutarotacja
 Wiązanie glikozydowe
 Glukoza i cyklodekstryny
 Laktoza
 Sacharoza
 Fukozylolaktozy
 Pentasacharyd mleka ludzkiego
 Faktor IX surowicy krwi ludzkiej
Laboratory
of Biological
Definicje
Sacharydy - związki zbudowanie z węgla, tlenu i wodoru.
Ich inna nazwa - węglowodany - nawiązuje do wzoru sumarycznego
Cm(H2O)n, który jednak nie zawsze jest prawdziwy.
Zawierają liczne grupy hydroksylowe (-OH) oraz mogą zawierać
szereg innych grup funkcyjnych.
Forma łańcuchowa zawsze posiada
grupę karbonylową (-CO-) lub aldehydową (-CHO); ketozy i aldozy.
Monosacharydy - pojedyncza jednostka cukrowa.
Oligosacharydy - niewielka liczba (zwykle 2 - 10)
reszt monosacharydowych połączonych wiązaniami glikozydowymi.
Polisacharydy - makrocząsteczki, w których bardzo duża liczba reszt
monosacharydowych jest połączona wiązaniami glikozydowymi.
Oligo- i polisacharydy mogą być: liniowe, rozgałęzione lub cykliczne.
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Dlaczego oligosacharydy są ważne dla biologa ?
Oligosacharydy organizmach występują samodzielnie
oraz w połączeniu z
białkami (glikoproteiny) i tłuszczami (glikolipidy).
Glikoproteiny - najliczniejsze białka złożone
występują w osoczu krwi, erytrocytach, błonach komórkowych,
tkankach łącznych, wydzielinach śluzowych, hormonach.
Glikolipidy występują w błonach komórkowych
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Monosacharydy - budowa
triozy - 3 atomy węgla,
tetrozy - 4 atomy węgla,
pentozy - 5 atomów węgla,
heksozy - 6 atomów węgla.
Większość biologicznie ważnych monosacharydów ma 5 lub 6 atomów węgla.
Laboratory
of Biological
Postać
Postać łańcuchowa
łańcuchowa monosacharydów
monosacharydów
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Przykład - dwie aldotetrozy:
erytroza i treoza.
1
2
3
4
enancjomery
D
erytrozy
L
Dwa asymetryczne (*) atomy węgla
powodują pojawienie się czterech
stereoizomerów.
Dla pentoz istnieje 233 = 8
stereoizomerów.
enancjomery
D
treozy
L
Dla heksoz istnieje 244 = 16
stereoizomerów.
Równowaga jest silnie przesunięta w stronę formy cyklicznej.
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Pojawiają się dwa kolejne diasteroizomery.
a-D-erytrofuranoza
D-erytroza
b-D-erytrofuranoza
D-treoza
a-D-treofuranoza
b-D-treofuranoza
Postać cykliczna monosacharydów
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Przy cyklizacji powstaje kolejny asymetryczny atom węgla C1 zwany anomerycznym.
Konfiguracja węgla anomerycznego jest oznaczana a lub b.
Cukry tworzące pierścienie pięcioczłonowe - furanozy,
Cukry tworzące pierścienie sześcioczłonowe - piranozy.
Znaczenie biologiczne mają D-monosacharydy. Nieliczne wyjątki dotyczą form L
jedynie kilku monosacharydów (L-Fuc, L-Glu, L-Gal,…)
a-D
a-L
piranozy
6
b-D
4
1
b-L
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
W roztworze zawsze istnieje równowaga pomiędzy
stereoizomerami a i b
Mutarotacja, to przejście a  b przez formę łańcuchową.
Np. dla glukozy
a: 36%
b: 64%
Laboratory
of Biological
Definicja kątów torsyjnych  i  określających konformację
wiązania glikozydowego na przykładzie disacharydu b-laktozy.
b-D-Galp(14)b-D-Glcp
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Galb(14)Glcb
: H1–C1–O1–C4’
: C1–O1–C4’–H4’
NOE: H1…H4’
3J(H1,C4’)
3J(C1,H4’)
Jeden ze sposobów określania konformacji wiązania glikozydowego.
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Polisacharydy
Celuloza: 4)Glc(b14)Glc(b1
łańcuch nierozgałęziony
Glikogen: 4)Glc(a14)Glc(a1 oraz Glc(a16)Glca
łańcuch rozgałęziony
Chityna: 4)GlcNAc(b14)GlcNAc(b1
łańcuch nierozgałęziony
Amyloza: 4)Glc(a14)Glc(a1
łańcuch nierozgałęziony
Amylopektyna: jak glikogen
Skrobia: ~25% amylozy i ~ 75% amylopektyny.
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Oligosacharydy – zagadnienia rozwiązywalne przy pomocy NMR
CO
Liczba i typ składników oligosacharydów
Połączenia cukrów w oligosacharydach
Konfiguracja anomerycznych atomów węgla
Konformacja wiązań glikozydowych
JAK
Przypisania sygnałów w widmach NMR
Informacje strukturalne z przesunięć chemicznych,
stałych sprzężenia spinowego i NOE
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Przesunięcia chemiczne 13C węgli anomerycznych
Glca(14)Glca,b (a-92.8, b-96.8); maltoza
100.7
Glcb(14)Glca,b (a-92.9, b-96.8); celobioza
103.6
Sprzężenia spinowe 3J(H1,H2) w piranozach
identyfikacja anomeru
a-anomer: (Glc, Gal, Fuc) J~2 – 4 Hz, (Man) J~1.6 Hz
b-anomer: (Glc, Gal, Fuc) J~7 – 9 Hz, (Man) J~0.8 Hz
Celobioza i maltoza (disacharydy) – 13C NMR
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
maltoza: Glca(1→4)Glca,b
celobioza: Glcb(1→4)Glca,b
celobioza
maltoza
Laboratory
of Biological
Przesunięcia chemiczne 1H - efekt podstawienia
a-Glc, 4)-[aGlc]6-(1 ,
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
4)-[aGlc]10-(1
3J(H1,H2)=3,6
Hz
Typowe wartości 3J(H1,H2)
dla anomerów a tych
monosacharydów, w których
H2 jest aksjalny.
3J(H1,H2)=3,4
Hz
Laktoza w DMSO;
Laboratory
of Biological
widoczne są protony OH.
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
b-D-Galp(14)[a,b]-D-Glcp
II
I
6.0
5.0
4.0
I1a
Glca: 3J(H1,H2) = 4,1 Hz
Glcb: 3J(H1,H2) = 7,3 Hz
Galb: 3J(H1,H2) = 7,5 Hz
prosta metoda odróżniania anomerów.
I1b
II1b
Kąty dwuścienne:
dla Hax–C–C–Hax =180
dla Hax–C–C–Heq =60
zależność Karplusa.
3.0
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Laktoza w DMSO
3.5
3.0
II4a,b
I5a
70
II2a,b
I3a
I2a
b-D-Galp(14)[a,b]-D-Glcp
II
I
II3a,b
I5b
I2b
I3b
II5a,b
75
Korelacja 1H/13C
bez H1 i H6.
80
I4a,b
3.6
3.4
3.2
3.0
Laboratory
of Biological
Disacharyd sacharoza
aGlcp(12)bFruf
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
6
10,0
9,3
O
2
O
9,2
9,2
O
1
O
3,7
10,0
3,6 Hz
O
6
O
O 1
O
O
O
O
G6
F6
F1
G4
F4
G2
G5 G3
F3
Brak sygnału korelacyjnego
dla F2, ponieważ C2(Fru)
jest czwartorzędowy.
F5
G1
Odczynnik:
Cukrownia Dobrzelin, kampania 2006.
Widma NMR:
Katarzyna Ruszczyńska-Bartnik.
Laboratory
of Biological
Fukozylolaktoza:
Galb(1→4)[Fuca(1→3)]Glca,b
1H NMR w DMSO
selektywne 1D TOCSY
Glcb
całe widmo
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Laboratory
of Biological
Fukozylolaktoza:
Galb(1→4)[Fuca(1→3)]Glca,b
1H NMR w DMSO
selektywne 1D TOCSY
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Częściowe widma fukoz – pobudzenie IV H1
Glca
Glcb
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Difukozylolaktoza:
Fuca(1→2)Galb(1→4)[Fuca(1→3)]Glca,b
13C
NMR w DMSO
Pentasacharyd wyizolowany z mleka ludzkiego
Galb(1→4)[Fuca(1→3)]GlcNAcb(1→3) Galb(1→4)Glc-ol
IV
V
III
II
I
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Widmo ROESY
J. Dąbrowski, A. Ejchart, R. Brunz, H. Egge,
FEBS Lett., 1989, 246, 229.
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Gliko-nonapeptyd,
Faktor IX surowicy krwi ludzkiej.
Przypisania - TOCSY
Sekwencja - ROESY
R.J. Harris, H. van Halbeek, J. Glushka, L.J. Basa,
V.T. Ling, K.J. Smith, M.W. Spellman,
Biochemistry, 1993, 32, 6539.
Neu5Aca(26)Galb(14)GlcNAcb(13)Fuca(1O)Ser61