Transcript Wykład prof. A. Ejcharta

Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Metody NMR stosowane w badaniach
biopolimerów
Część 3:
Badania strukturalne oligonukleotydów
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Budowa kwasów nukleinowych – schemat ogólny
zasada
azotowa
zasada
azotowa
zasada
azotowa
5' cukier 3' fosforan 5' cukier 3' fosforan 5' cukier 3'
5' koniec
3' koniec
Laboratory
of Biological
Budowa kwasów nukleinowych
część cukrowa – struktury
2'-deoksyryboza
zasada
zasada
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
ryboza
Laboratory
of Biological
Budowa kwasów nukleinowych
część cukrowa – przesunięcia chemiczne
1H
[ppm]
DNA
G A
H1' 5.8 5.8
H2' 2.6 2.6
H2'' 2.7 2.8
H3' 4.9 5.0
H4' 4.4 4.4
H5' 4.0 4.2
H5'' 4.1 4.2
C
5.5
2.0
2.3
4.8
4.1
4.1
4.3
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
RNA
T
6.0
2.1
2.6
4.9
4.2
-
G
5.6
4.6
4.5
4.4
4.3
4.1
A
6.0
4.7
4.7
4.5
4.5
4.2
C
5.6
4.5
4.5
4.4
4.4
4.0
U
5.6
4.3
4.6
4.3
4.3
4.0
13C
[ppm]
DNA RNA
C1' 86
C2' 40
C3' 80
C4' 88
C5' 65
87-92
74-76
70-75
80-84
63-69
Budowa kwasów nukleinowych
zasady azotowe – struktury
cytozyna
tymina
Laboratory
of Biological
A, G – puryny
C, T(U) - pirymidyny
uracyl
guanina
adenina
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Budowa kwasów nukleinowych
zasady azotowe – przesunięcia chemiczne 1H
zasada
niewymienialne
wymienialne
T
H(6) 6.9-7.9
NH (3) 13-14
CH3(5) 1.0-1.9
U
H(5) 5.0-6.0
NH(3) 13-14
H(6) 6.9-7.9
C
H(5) 5.0-6.0
NH2(4) 6.7-7.0 / 8.1-8.8
H(6) 6.9-7.9
A
H(2) 7.5-8
NH2(6) 5-6 / 7-8
H(8) 7.7-8.5
G
H(2) 7.5-8.0
NH(1) 12-13.6
H(8) 7.5-8.3
NH2(2) 5-6 / 8-9
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Budowa kwasów nukleinowych
zasady azotowe – przesunięcia chemiczne 13C i 15N
G
N1 160
C2 157
N3 146
C4 162
C5 117
C6 154
N7 233
C8 138
N9 170
NH2
DNA
A C
213
155
222
158
120
150
230
142
170
151
159
196
168
99
143
T
G
142
154
160
170
114
140
146
157
160
153
117
162
233
138
169
75
135
168
RNA
A C
222
151
213
150
120
157
230
151
158
196
169
95
138
81 98
U
142
154
160
169
100
139
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Laboratory
of Biological
Budowa kwasów nukleinowych
sprzężenia spinowe
cukier
1J(C1’H1’) 170-180
1J( C2’H2’) 155-160
1J( C3’H3’) 140-150
1J( C4’H4’) 145-155
1J( C5’H5’) 145-150
1J( C5’H5’’) 145-150
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
zasada azotowa
imina 1J(NH)
90
1J(CH) 180-225
1J(C8N9)
4-8
1J(C8N7)
10
1J(C6N1)
13
cukier – zasada
1J(C1’N1)
11-13
1J(C1’N9)
11-13
Laboratory
of Biological
Komplet sprzężeń 1J w guaninie
O
H1
H
N2
H
N1
C2
C6
N3
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
G
calc
GTP
exp
C8-H8
210.0
216.3
N2-H2
-93.3
-91.7
-90.1
C4-C5
57.6
63.5
C4-N9
-19.8
-19.2
C5-C6
96.6
87.9
C5-N7
6.8
4.1
C6-N1
-2.0
-5.9
C8-N9
-5.9
nakład
C8-N7
-8.7
nakład
A
C5
C4
N7
C8
N9
B
H8
K. Ruszczyńska et al., Biophysical Journal, 85, 1450 (2003).
Struktura drugorzędowa kwasów nukleinowych
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
http://rmn.iqfr.csic.es/guide/eNMR/adn/watson.html
Struktury przestrzenne kwasów nukleinowych
dwuniciowe helisy
B
A
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Z
B: typowa dla dwuniciowego DNA w komórkach
A: dwuniciowy RNA i DNA+RNA
Z: obszary DNA posiadające naprzemiennie puryny i pirymidyny; np. 5'-CGCGATCG-3'
Struktury przestrzenne kwasów nukleinowych
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
trypleksy
tetrapleksy
Struktury przestrzenne kwasów nukleinowych
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Motywy drugorzędowe struktury RNA
Rodzaje RNA
rybosomalny (rRNA)
matrycowy (mRNA)
transportujący (tRNA)
niekodujący (ncRNA)
Struktury RNA
Laboratory
of Biological
Przypomnienie
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Ogólna strategia wyznaczania struktur białek
1) Przypisanie sygnałów.
2) Identyfikacja więzów.
3) Generowanie struktur spełniających więzy doświadczalne.
Postępowanie w punktach 1 i 2 zależy od wielkości
badanego białka lub kompleksu białkowego.
Postępowanie w punkcie 3 zależy od rodzajów
i liczby dostępnych więzów.
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Ogólna strategia wyznaczania struktur kwasów nukleinowych
1) Przypisanie sygnałów.
2) Identyfikacja więzów.
3) Generowanie struktur spełniających więzy doświadczalne.
Postępowanie w punktach 1 i 2 zależy od wielkości
badanego kwasu nukleinowego.
Postępowanie w punkcie 3 zależy od rodzajów
i liczby dostępnych więzów.
Laboratory
of Biological
RNA - 34 nt; typowe widmo 1H NMR
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
H2',H3',H4',H5',H5''
NH
H2,H6,H8,NH2
H5,H1'
DNA - 20 nt; typowe widmo 1H NMR
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
różnice względem RNA: H2',H2'' oddzielone; CH3(T)
Przypisanie sygnałów: RNA - korelacje H1'/H2'
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Przypisanie sygnałów: RNA – korelacje H1'/C1'
20-nt RNA, naturalna zawartość 13C, 30 oC
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Przypisanie sygnałów: RNA –korelacje H2'/C2'…H5'H5''/C5'
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Przypisanie sygnałów: DNA – korelacje H2/H7 w tyminach
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Przypisanie sygnałów: korelacje H5/H6
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
w cytozynach i uracylach
Przypisanie sygnałów: korelacje C5/H5
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
w cytozynach i uracylach
Laboratory
of Biological
Przypisania sekwencyjne: korelacje
1H/31P
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Przypisania sekwencyjne:
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
RNA – korelacje H5/H1'
A
15 G
C
U
G
G
10 A
H2 / H6 / H8 (ppm)
2D NOESY
C33
G1
U
G
A
U
5G
G
A
A
G
A 20
C
C
A
U
U 25
C
U
G
C
C 30
U
G C
G C
2.45 Å
C26 H5-H6
5’
800 MHz, m=300ms, 100% 2H2O, 25°C
A
H1' / H5 (ppm)
3’
Przypisania sekwencyjne: RNA – korelacje H6,H8/H1'
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
20 nt RNA, NOESY
Przypisania sekwencyjne: DNA – korelacje H6,H8/H1'
27 nt DNA, NOESY
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Inne możliwe przypisania sekwencyjne: DNA i RNA
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
H6,H8/H2'
H6,H8/H2'
H6,H8/H2''
2H6,H8/H3'
H6,H8/H4'
Przypisania sekwencyjne: korelacje
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
U20G21
G19 A22
G18 – C23
G17 – C24
C16 – G25
A15 – U26
U13 C14 – G27
C12
C11
U10
U9 A8
C7 – G28
A6 – U29
G5 – C30
G4 – C31
A3 – U32
G2 – C33
G1 – C34
protonów iminowych (tylko G i T/U)
Przypisania w oligonukleotydach znakowanych
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
cukry
3D HCCH-COSY
3D HCCH-TOCSY
zasady
3D HbCbNb
H6-C6-N1
H8-C8-N9
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Przypisania w oligonukleotydach znakowanych : cukier - zasada
3D HCN lub 2D H(C)N
H1'-C1' -N1/N9
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Przypisania w oligonukleotydach znakowanych : cukier - zasada
2D H(C)N
Laboratory
of Biological
Więzy wiązań wodorowych – parowanie zasad
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
6 – 7 Hz
1hJ
NH
2 – 4 Hz
2J
H
H
N C
H
C
2D H(N)N-COSY
H
H
N C
N C
C
-2 Hz
NN
N
-6 Hz
AiG
(pier. 5 cz.)
H
N C
N
-11 Hz H
AiG
(pier. 5 cz.)
N
-17 Hz
A
(pier. 6 cz.)
Laboratory
of Biological
Parowanie
zasad
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
2D NOESY
N1
1H
(ppm)
15N
N3
(ppm)
N3
N1
2D HNN-COSY
800 MhHz, 95% H2O, 5°C
1H
(ppm)
10
800 MHz, 95% H2O, 5°C
1H
(ppm)
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Powody, dla których dotychczas wyznaczono niewiele
struktur oligonukleotydów
DNA mało interesujące – podwójna helisa, parowanieW-C
RNA – interesujące, ale znacznie trudniejsze:
widma trudniejsze w interpretacji – degeneracja przesunięć
chemicznych w cukrach,
trudne w otrzymywaniu: trzeba dysponować znakowanymi
trójfosforanami rybonukleotydów, matrycą DNA i polimerazą
RNA; niska wydajność,
bardzo trudne w utrzymaniu: rozkład powodują ślady metali,
nukleazy, autoliza i znikają