Transcript Wykład prof. A. Ejcharta

Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Metody NMR stosowane w badaniach
biopolimerów
Część 2:
Badania strukturalne białek
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Badanie struktury białek
 Budowa białek
 Przesunięcia chemiczne w białkach
 Więzy NMR
 Ogólna strategia wyznaczania struktur białek
 Małe białka
 NOE - odległości H…H
 Stałe sprzężenia spinowego - kąty dwuścienne
 Średnie białka
 Wielowymiarowe korelacje heterojądrowe
 Widma NOESY redagowane izotopowo
 Sprzężenia spinowe przez wiązania wodorowe
 Resztkowe sprzężenia dipolowe
 Duże białka
 Deuterowanie i TROSY
A. Ejchart, Wiadomości Chemiczne, 2005, 59, 23-45.
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Budowa białek
Podstawowe aminokwasy
naturalne wchodzące
w skład białek.
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Budowa białek
Łączenie aminokwasów
w łańcuch polipeptydowy:
struktura pierwszorzędowa
H
H
O
R

i
+
1


C
N
C

i
+
1
i
i
C

C
N

i
i
1
i
+
1
k
o
n
i
e
c
N
k
o
n
i
e
c
C
H
R
O
H

i
i
t
a
r
e
s
z
t
a
a
m
i
n
o
k
w
a
s
o
w
a
Konformację głównego łańcucha polipeptydowego określają kąty , , .
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Budowa białek
Elementy struktury drugorzędowej
helisy, b-kartki, zgięcia,
są stabilizowane wiązaniami wodorowymi.
Typowe wiązania wodorowe w białkach[Ǻ]
hydroksyl-hydroksyl: OHOH 2,80,1 Ǻ
hydroksyl-karbonyl:
OHO=C 2,80,1 Ǻ
amid-karbonyl:
>NHO=C 2,90,1 Ǻ
amid-hydroksyl:
>NHOH 2,90,1 Ǻ
amid-azot imidazolowy: >NHN
3,10,2 Ǻ
amid-siarka:
>NHS
3,70,2 Ǻ
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Budowa białek
Helisa 310
Helisa 
310: CO(i)···HN(i+3)
: CO(i)···HN(i+4)
: CO(i)···HN(i+5)
Helisa 
Struktura drugorzędowa
helisy
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Budowa białek
Struktura drugorzędowa
b-kartki
(b) antyrównoległa 3-niciowa b kartka
(c) równoległa 3-niciowa b kartka
GSELETAMETLINVFHAHSGKEGDKYKLSKKELKELLQT
T
ELSGFLDAQKDADAVDKVMKELDEDGDGEVDFQEYVVL
VAALTVACNNFFWENS
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Budowa białek
Przykład – białko S100A1
budowa pierwszorzędowa,
budowa drugorzędowa,
budowa trzeciorzędowa,
budowa czwartorzędowa.
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Spektroskopia NMR dostarcza informacje na poziomie atomowym.
Powody przydatności spektroskopii NMR w strukturalnych badaniach białek:

istnieją magnetycznie czynne izotopy biologicznie ważnych pierwiastków
(1H, 13C, 15N, 31P),

wszystkie parametry widmowe odzwierciedlają nawet niewielkie zmiany
strukturalne,

oddziaływania międzyjądrowe wpływają na formę i intensywność sygnałów w
widmach NMR,

możliwość uzyskania trójwymiarowej struktury o dużej dokładności w roztworze,
w warunkach fizjologicznych co pozwala na rezygnację z krystalizacji.
Laboratory
of Biological
Czynniki utrudniające wykorzystanie NMR
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Niska czułość spektroskopii NMR. Obecnie typowa ilość białka potrzebna do badań NMR
wynosi około 0,5 M czyli o kilka rzędów wielkości więcej niż ilość potrzebna do pomiarów
optycznych czy w spektrometrii masowej. Ponadto białko nie powinno agregować przy
stężeniach rzędu 1 mM/l.
Czasochłonność pomiarów NMR. Białko musi być stabilne w roztworze w temperaturze
pokojowej co najmniej przez kilkanaście dni.
Sygnały w widmach białek poszczególnych izotopów są silnie ponakładane. Na przykład
w białku składającym się z 200 reszt aminokwasowych należy oczekiwać około 1200
sygnałów izotopu 1H, 1000 sygnałów izotopu 13C i ponad 200 sygnałów izotopu 15N
występujących w wąskich przedziałach częstości.
Bardzo silny sygnał rozpuszczalnika jakim jest woda utrudnia obserwację widm 1H NMR,
zwłaszcza ważnego diagnostycznie obszaru sygnałów H, S(H2O)/S(białko)  105.
W dużych białkach sygnały ulegają poszerzeniu tracąc strukturę subtelną ze względu na
wolniejszą reorientację dyfuzyjną.
Np. dla MW = 20 kDa: HW(H)  25 Hz a HW(HN)  12 Hz.
Więzy strukturalne otrzymane z widm NMR są niejednoznaczne, co powoduje, że ich
liczba musi być znacznie większa od liczby konformacyjnych stopni swobody.
Powolna skala czasowa spektrometrii NMR powoduje uśrednianie konformacji.
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Sposoby na przezwyciężenie problemów w wyznaczaniu struktur białek:
 postęp w konstrukcji spektrometrów (silniejsze pola B0, gradienty,
kriosondy),
 znakowanie izotopowe (jednorodne, selektywne, segmentowe),
 nowe metody pomiarowe (ND, TROSY),
 nowe rodzaje więzów strukturalnych (RDC, relaksacja).
Rybonukleaza (124 reszty, 15 mM, B0 =0,94 T {40 MHz})
M. Saunders, A. Wishnia, J.G. Kirkwood, J. Am. Chem. Soc., 1957, 79, 3289.
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Lizozym (129 reszt, 1 mM, B0 = 17,6 T {750 MHZ})
J.N.S. Evans, Biomolecular NMR Spectroscopy, Oxford University Press, 1995, str.4
Typowe zakresy przesunięć chemicznych w białkach
H
,
a
r
o
m
.
N
1
0
8
H
,
H
(
S
)

b
6
4
H
,
H
,
.
.
.
b

2
1H:
0
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
przypisania – bardzo ważne HN
NOE – bardzo ważne Hb, H, …
1

(
H
)
13C:
C
,
C
,
.
.
.
b

C
'
a
r
o
m
.
2
0
0
1
6
0
1
2
0
przedziały C' i C są odległe
C
,
C
(
S
,
T
)C
(
G
)

b

8
0
4
0
0
1
3

(
C
)
(15N) amidy w łańcuchu głównym oraz łańcuchach bocznych
Asn , Gln i Trp: 105 – 130 ppm.
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Przypisanie sygnałów w widmach izotopów 1H i 13C pozwala
na identyfikację obszarów obejmujących struktury drugorzędowe
w oparciu o podejście statystyczne wykorzystując:
przesunięcia chemiczne w modelowych peptydach
i białkach o znanych strukturach - CSI,
D.S. Wishart et al., J. Biomol. NMR, 5, 67-81 (1995)
przesunięcia chemiczne w białkach o znanych
strukturach krystalograficznych - TALOS, TALOS+
G. Cornilescu, F. Delaglio, A. Bax, J. Biomol. NMR, 13, 289-302 (1995)
Y. Shen, F. Delaglio, G. Cornilescu, A. Bax, J. Biomol. NMR, 44, 213-223 (2009)
PREDITOR
M.V. Berjanskii, S. Neal, D.S. Wishart, Nucl. Acids Res., 34, W63-W69 (2006)
CS23D (struktura trzeciorzędowa)
D.S. Wishart, D. Arndt, M.V. Berjanskii, P. Tang, J, Zhou, G. Lin, Nucl. Acids Res.,
36, W496-W502 (2008)
Laboratory
of Biological
CSI - Chemical Shift Index
0
5
1
0
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
1
5
3
Peptyd wiążący jony wapnia.
(C) [ppm]
2
1
0
1
2
(H) [ppm]
0
.
4
0
.
2
0
.
0
0
.
2
0
.
4
0
5
1
0
R
e
s
z
t
a
n
r
1
5
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Struktura przestrzenna podjednostki dimerycznego białka S100A1
otrzymana z przesunięć chemicznych (CS23D) i wszystkich więzów (X-PLOR)
CS23D
X-PLOR
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Przestrzenna (3D) struktura cząsteczki zbudowanej z N atomów
jest całkowicie zdefiniowana przez
(3N - 6) wpółrzędnych wewnętrznych:
- odległości międzyatomowe (zwykle długości wiązań),
- kąty pomiędzy wiązaniami,
- kąty dwuścienne.
Długości wiązań i kąty walencyjne
są tymi parametrami strukturalnymi,
które zwykle charakteryzują się
małymi zmianami wartości.
Laboratory
of Biological
Jakie więzy można otrzymać przy pomocy NMR?

W1:

W2:

Odległości pomiędzy protonami:
jądrowy efekt Overhausera (NOE).
Kąty dwuścienne:
wicynalne sprzężenia spinowe (3J).
Odległości pomiędzy donorem i akceptorem
w wiązaniu wodorowym:
W3:
sprzężenia skalarne (nhJ).

Orientacja wektorów międzyjądrowych
w molekularnym układzie współrzędnych:
W4:
resztkowe sprzężenia dipolowe ().

Wzajemna orientacja wiązań:
informacyjnie: interferencja mechanizmów relaksacji (G).
Więzy NMR są niejednoznaczne !
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Laboratory
of Biological
W1
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
NOESY - odległości pomiędzy protonami
Intensywność sygnału korelacyjnego w widmie NOESY zależy
od odległości pomiędzy oddziałującymi jądrami: I ~ dij-6
i szybko maleje z odległością.
Warunki dokładnego wyznaczenia odległości:
• znajomość odległości kalibracyjnej I1/I2 ~ (d1/d2)-6,
• izotropowa reorientacja dyfuzyjna cząsteczki,
• wyeliminowanie dyfuzji spinowej (krótkie czasy mieszania),
• sztywna struktura (brak ruchów segmentowych czy lokalnych).
W1
NOESY - odległości kalibracyjne
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Jako niezmienne, znane odległości pomiędzy protonami można wybrać:
• odległości pomiędzy protonami geminalnymi, d  1,8 Å,
• odległości pomiędzy protonami w resztach aromatycznych
np. pomiędzy protonami H i He w tyrozynie, d  2,5 Å.
NOESY - reorientacja dyfuzyjna cząsteczki
dyfuzja spinowa
Przy anizotropowej reorientacji
cząsteczki, wektory HH różniące
się kierunkami są scharakteryzowane
przez różne czasy korelacji.
W1
Laboratory
of Biological
NOESY - dyfuzja spinowa
Liniowy układ sześciu spinów:
zakł.  1  2  3  4  5  6
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
W1
NOESY - ruchy konformacyjne
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Odległość otrzymana z NOE przy uśrednieniu pomiędzy dwoma konformerami
o równych populacjach i odległościach H…H: r1 = 2 Å oraz r1 = r2.
Przykład: szybkie uśrednienie dwóch konformacji, w których odległości H…H
wynoszą 2 Å i 4 Å przy założeniu jednej sztywnej konformacji odpowiada d=2,4 Å.
W2
Laboratory
of Biological
Wicynalne sprzężenia skalarne - kąty dwuścienne
Zależność Karplusa:
3J()
Mankamenty tego rodzaju więzów:
Przykład: jeden z kątów szkieletu białka - .
Projekcja Newmana dla  = 0.
C
'



C
'
N
C
H
b

H
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
= A·cos2 + B·cos + C
konieczność kalibracji,
niejednoznaczność zależności Karplusa.
W2
Laboratory
of Biological
Wicynalne sprzężenia spinowe - kąty dwuścienne
Doświadczalne zależności
dla homo- i heterojądrowych
sprzężeń w białkach zależne
od kąta dwuściennego .
1
0
H
N
C
H

H
N
C
C
'

H
N
C
C

b
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
C
'
N
C
H

C
'
N
C
C
'

C
'
N
C
C

b
8
Konieczne znakowanie
izotopowe.
J [Hz]
6
4
C
'



C
'
2
N
C
H
b

H
0
1
8
01
2
0 6
0
0

6
0 1
2
0 1
8
0
W2
Wicynalne sprzężenia spinowe - kąty dwuścienne
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Pomiar homojądrowego
sprzężenia spinowego
w białku znakowanym 15N.
W3
Laboratory
of Biological
Sprzężenia spinowe przez wiązania wodorowe
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
C

N
H
O
C
h3J
NC’:
-0,2 do -0,9 Hz
HC’:
-0,6 do 1,3 Hz
HC:
0 do 1,4 Hz
C

N
H
O
C
h2J
C

N
H
O
C
h3J
Niezbędne jest znakowanie izotopowe 15N/13C
kartka b -0,65 ± 0,14 Hz
helisa  -0,38 ± 0,12 Hz
W3
Sprzężenia spinowe przez wiązania wodorowe
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
s, i - niestłumione korelacje
sekwencyjne i intrarezydualne
HNCO:
HN(i)N(i)(f1)C'(i-1)(f2)N(i)HN(i)(f3)
JNC' = 15 Hz; CT = 1/2JNC' = 33 ms (maks. CT)
H(N)CO:
HN(i)N(i)C'(i-1)(f1)N(i)HN(i)(f2)
CT = 2/JNC' = 132 ms (min. CT) dobre dla J = 3,7 Hz
A.J. Dingley, F. Cordier, V.A. Jaravine, S. Grzesiek,
w BioNMR in drug research, Wiley-VCH, 2003, str. 207.
W4
Resztkowe sprzężenia dipolowe - RDC
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
W środowisku izotropowym oddziaływania dipolowe uśredniają się do zera.
Jedynym ich przejawem jest obecność jądrowego efektu Overhausera - NOE.
W środowisku anizotropowym, wymuszającym częściowe uporządkowanie
cząsteczek, pojawiają się resztkowe sprzężenia dipolowe. Ich wielkość zależy
od stopnia uporządkowania, ilościowo opisanego przez tensor uporządkowania A.
Orientacje wektorów określających
oddziaływanie dipolowe danego typu
są zdefiniowane w w tym samym
układzie osi własnych tensora A
dla całej cząsteczki.
RDC stanowią
więzy dalekozasięgowe
W4
Resztkowe sprzężenia dipolowe - RDC
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Metody orientowania białek w roztworach
Białka paramagnetyczne
Wykorzystanie fazy nematycznej
(bicelle, fagi, krystality celulozy)
bicelle
fagi
Purpurowa membrana
(bakteriorodopsyna)
Ściśnięty żel poliakrylamidowy
W4
Laboratory
of Biological
Resztkowe sprzężenia dipolowe - RDC
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
RDC = DAX·[Aa·(3cos2  1) + 1.5·Ar·sin2·cos2]
DAX = 0AXh/163rAX3 [Hz]
Aa = Azz - (Axx  Ayy)/2,
Ar = Axx  Ayy
A
z
z
A
D – stała sprzężenia dipolowego,
A – tensor uporządkowania.

X

A
x
x
H
H
O
R




C
N
C

i
+
1
i
i
C
C
N

i
i
1
i
+
1
N
k
o
n
i
e
c
C
k
o
n
i
e
c
R
H
O

H
Przykładowe sprzężenia dipolowe
DNH: -24 kHz
DCH: 47,9 kHz
DHH: 10 - 22 kHz
A
y
y
W4
Resztkowe sprzężenia dipolowe - RDC
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Fragmenty widm 1H,15N HSQC
dla białka S100A1 znakowanego 15N
mierzone w środowisku izotropowym
oraz w roztworze zawierającym bicelle.
izotropowy
anizotropowy
Laboratory
of Biological
Ogólna strategia wyznaczania struktur białek
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
1) Przypisanie sygnałów.
2) Identyfikacja więzów.
3) Generowanie struktur spełniających więzy doświadczalne.
Postępowanie w punktach 1 i 2 zależy od wielkości
badanego białka lub kompleksu białkowego.
Postępowanie w punkcie 3 zależy od rodzajów
i liczby dostępnych więzów.
Postępowanie przy wyznaczaniu struktur białek
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Mcz < 10 kDa:
1
H 2D NMR
Mcz > 10 kDa: dwa równoległe ograniczenia
a) postępujące nakładanie się sygnałów,
b) poszerzenie sygnałów spowodowane wolniejszą
reorientacją dyfuzyjną.
Metody postępowania:
znakowanie izotopowe 15N/13C/2H (zależnie od
wielkości),
Mcz < 30 kDa: 15N/13C,
Mcz > 30 kDa: 15N/13C/2H,
heterojądrowe techniki 3D i 4D, technika TROSY.
Naturalny skład izotopowy
2D; 1H
< 10 kDa
Podwójne znakowanie 15N/13C
nD; 1H/15N/13C
< 30 kDa
Całkowite i niecałkowite deuterowanie
nD; 1H/15N/13C/2H < 60 kDa
Selektywne znakowanie izotopowe:
TROSY
miejscowo, aminokwasowo, segmentowo
+ 100 kDa
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Małe białka:
Mcz < 10 kDa
Dwuwymiarowe (2D) widma 1H NMR.
1. Identyfikacja układów spinowych poszczególnych reszt aminokwasowych w
oparciu o korelacje przez wiązania chemiczne (TOCSY, COSY). Brak
rozróżnienia pomiędzy resztami tego samego typu lub o takiej samej symetrii
układu spinowego.
2. Sekwencyjne przypisanie poszczególnych reszt aminokwasowych w oparciu
o oddziaływania dipolowe HNi/HNi+1 oraz Hi/HNi+1 (NOESY).
3. Otrzymanie więzów strukturalnych:
odległości – NOESY,
kąty dwuścienne – 3J(HN,H).
Laboratory
of Biological
Ważne obszary korelacji homojądrowych 1H/1H
fingerprint region
H
,
A
r
N
H
,
H
,
.
.
.

b
0
2
T
O
C
S
Y
N
O
E
S
Y
4
 [ppm]
N
O
E
S
Y
6
8
N
O
E
S
Y
1
0
1
0
8
6
4

[
p
p
m
]
2
0
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Widmo TOCSY
heksadekapeptydu;
fingerprint region.
Identyfikacja sygnałów należących
do poszczególnych reszt i podział
według topologii układu spinowego.
Asp1-Lys2-Asp3-Gly4-Asp5-Gly6-Tyr7-Ile8-Ser9-Ala10-Ala11-Glu12-Ala13-Ala14-Ala15-Gln16
H (0,76)
Korelacje izoleucyny
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
H2 (0,86)
(C)=13,1
H1 (1,57)
Korelacja 1H/13C
Hb (1,83)
(H)=0,86
(C)=17,7
Pierwotne przypisanie
(H,Ile) = 0,76
było błędne.
(H)=0,76
H (4,47)
HN (9,53)
(C)=27,2
HN–CH(COO)–CbH(C2H3) –C1H2–CH3
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Asp1-Lys2-Asp3-Gly4-Asp5-Gly6-Tyr7-Ile8-Ser9-Ala10-Ala11-Glu12-Ala13-Ala14-Ala15-Gln16
Widmo NOESY
heksadekapeptydu,
obszar HN/HN.
Przypisania sekwencyjne:
sekwencja Lys2 - Tyr7,
sekwencja Ala10 - Gln16.
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Dla białek większych niż 10 kDa
widma 2D NOESY stają się
nieczytelne.
Fragment widma 2D NOESY
interleukiny 1b (17,4 kDa).
G.M. Clore, L.E. Kay, A. Bax, A.M. Gronenborn
Biochemistry, 30, 12-18 (1991).
Laboratory
of Biological
Wielowymiarowa spektroskopia NMR
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Homo- czy heterojądrowe techniki NMR ?
- Do pomiarów heterojądrowych konieczne jest wzbogacenie izotopowe 15N/13C.
- Czułość sekwencji heterojądrowych 3D jest większa niż homojądrowych 3D
i porównywalna z czułością sekwencji homojądrowych 2D.
- Przeniesienie koherencji jest wydajne wtedy, gdy szerokości połówkowe sygnałów
nie są większe niż stałe sprzężenia skalarnego.
Korelacje homojądrowe: J(HH)<18 Hz.
Korelacje heterojądrowe: J(CH)<120 Hz, J(NH)90 Hz.
- Liczba sygnałów w widmach homojądrowych szybko rośnie z liczbą wymiarów
zwiększając stłoczenie i zmniejszając czułość, zaś w widmach heterojądrowych
pojawiają się jedynie specyficzne sygnały korelacyjne.
- Przesunięcia chemiczne heterojąder zwiększają rozproszenie sygnałów.
Średnie białka:
10 kDa < Mcz < 30 kDa
Laboratory
of Biological
jednorodne znakowanie 15N/13C, heterojądrowe techniki 3D i 4D.
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
1. Przypisanie sygnałów 1H, 15N i 13C w oparciu o wielojądrowe,
wielowymiarowe techniki wykorzystujące przeniesienie magnetyzacji
przez duże, heterojądrowe sprzężenia spin-spin.
2. Otrzymanie więzów strukturalnych:
odległości – 3D i 4D 15N/13C redagowane NOESY,
pozostałe rodzaje więzów – różne techniki heterojądrowe, głównie 2D.
H
H
b
b
1
4
0
H
H
O
C

b
1
4
0
3
5
5
5
1
5
C
N
C

C
1
1
C
 N
7
9
2
H
C
O

bH
Laboratory
of Biological
W widmach korelacyjnych do przeniesienia magnetyzacji
wykorzystuje się sieć sprzężeń spinowych 1J i 2J,
które zazwyczaj mają duże wartości.
Znakowanie, oprócz zwiększenia czułości pomiaru, tworzy
sieć aktywnych magnetycznie heterojąder co umożliwia
przenoszenie magnetyzacji wzdłuż szkieletu białka.
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
H
H
b
b
1
4
0
H
H
O
C

b
1
4
0
3
5
5
5
1
5
C
N
C

C
1
1
C
 N
7
9
2
H
C
O

bH
Laboratory
of Biological
Dlaczego większość widm NMR białek mierzy się w H2O ?
Podwójnie znakowane 15N/13C-S100A1
30 min po rozpuszczeniu
tydzień po rozpuszczeniu
Rozpuszczalnik H2O
Rozpuszczalnik D2O
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Laboratory
of Biological
Schemat Hexc→X→Hdet
można realizować na dwa sposoby
"out and back" oraz "one way" transfer
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
nazewnictwo
one way
out and back
one way:
H→C(t1)→N(t2)→HN(t3); (H)CANNH
out and back: HN→N→C(t1)→N(t2)→HN(t3); HNCA
Uwzględniając relaksację schemat "out and back" jest w tym przypadku 4 razy czulszy
Przypisania sygnałów łańcucha głównego
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Podstawowe widmo: 2D 1H-15N HSQC koreluje: Ni, HNi
Przykład: białko holo-S100A1, tionylowane homocysteiną na Cys85,
2*93 reszty aminokwasowe, m.cz. 21 kDa.
Dalsze dane widmowe dla tego samego białka.
Przypisania sygnałów łańcucha głównego
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
1J(N C' ) = 15 Hz; 2J(N C' ) ≈
i i-1
i i
1J(N C' ) = 11 Hz; 2J(N C'
i i
i i-1)
0 Hz
= 7 Hz
(C'): 170-185 ppm; (C): 40-70 ppm
Wartości stałych J prowadzą do par widm korelacyjnych
HN(CO)CA: Ni, HNi, Ci-1; HNCA: Ni, HNi, Ci, Ci-1
Przypisania sygnałów łańcucha głównego
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
HN(CO)CA: Ni, HNi, Ci-1
HNCA: Ni, HNi, Ci, Ci-1
Przypisania sygnałów łańcucha głównego
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
HNCO: Ni, HNi, C'i-1; (HCA)CO(CA)NH: Ni, HNi, C'i, C'i-1
one way: H→C→C'(t1)→C→N(t2)→HN(t3); (HCA)CO(CA)NH
out and back:HN→N→C'(t1)→N(t2)→HN(t3); HN(CA)CO
W tym przypadku transfer „one way" jest czulszy niż "out and back".
Para widm najbardziej różniących się czułością.
Przypisania sygnałów łańcucha głównego
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
HNCO: Ni, HNi, C'i-1
(HCA)CO(CA)NH: Ni, HNi, C'i, C'i-1
Przypisania sygnałów łańcucha głównego
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
(HBHA)CBCA(CO)NH: Ni, HNi, Ci-1, Cbi-1 (one way)
HNCACB: Ni, HNi, Ci-1, Cbi-1, C1, Cbi (out and back)
HHb→CCb(t1)→C'→N(t2)→HN(t3); (HBHA)CBCA(CO)NH
HN→N→CCb(t1)→N(t2)→HN(t3); HNCACB
Przypisania sygnałów łańcucha głównego
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
(HBHA)CBCA(CO)NH: Ni, HNi, Ci-1, Cbi-1
HNCACB: Ni, HNi, Ci-1, Cbi-1, C1, Cbi
Przypisania sygnałów łańcucha głównego
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Kolejna para komplementarnych sekwencji impulsowych
do wykonania w przypadku potrzeby.
HBHA(CBCACO)NH: Ni, NHi, Hi-1, Hbi-1
HBHA(CBCA)NH: Ni, HNi, Hi-1, Hbi-1, Hi, Hbi
Skorelowane grupy 12 sygnałów dwóch sąsiadujących reszt
Wymagają ułożenia pasujących odpowiednio grup:
Ni, HNi, C'i-1, Ci-1, Cbi-1, Hi-1, Hbi-1, C'i, Ci, Cbi, Hi, Hbi
Ni+1, HNi+1, C'i, Ci, Cbi, Hi, Hbi, C'i+1, Ci+1, Cbi+1, Hi+1, Hbi+1
Przypisania sygnałów łańcuchów bocznych
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Szczególnie ważne są przypisania sygnałów 1H,
gdyż są konieczne do identyfikacji kontaktów NOE.
Dwie sekwencje pozwalające na przypisania prawie
wszystkich jąder C i H reszty poprzedzającej NH:
(H)C(CO)NH i H(CCO)NH
Uzupełniające sekwencje:
HC(C)H -TOCSY i (H)CCH -TOCSY
Przypisania automatyczne - MARS
Laboratory
of Biological
Podstawowe widma
2D 1H-13C HSQC
korelują: C/H
aromatyczne
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
alifatyczne
Laboratory
of Biological
Paski z widma
(H)C(CO)NH
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Resztą poprzedzającą Tyr26
jest Lys25
Łańcuchy boczne:
K: CbH2CH2CH2CeH2NH2
Y: CbH2
L: CbH2CH(C1H3)C2H3
S: CbH2OH
Laboratory
of Biological
Jądrowy efekt Overhausera
Widma NOESY edytowane izotopowo 15N i 13C
15N-edytowane
NOESY:
NOE
HN,C(t1) → HN→N(t2)→HN(t3); HN/HN, HC/HN
13C-edytowane NOESY:
NOE
HN,C(t1) → HC→C(t2)→HC(t3); HN/HC, HC/HC
Dodatkowe etapy przeniesienia magnetyzacji stwarzają
nowe możliwości: a) wyboru, b) liczby wymiarów
HN,C→N→HN(t1) NOE
→ HN→N(t2)→HN(t3); HN/HN
NOE
HN,C→C(t1)→HC(t2) →
HC→C(t3)→HC(t4); HC/HC
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
15N-edytowane
NOESY
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
13C-edytowane
NOESY
Leucyna:
L: CbH2CH(C1H3)C2H3

b

1
2
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Półautomatyczna lub ręczna identyfikacja więzów NOE
Kalibracja i półilościowy podział według intensywności:
silne (2.0 Å – 3.5 Å)
średnie (2.0 Å – 4.5 Å)
słabe (2.0 Å – 5.5 Å)
b. słabe (2.0 Å – 6.0 Å)
Pułapki:
- niejednoznaczność więzów,
- nałożenie sygnałów korelacyjnych,
- dyfuzja spinowa,
- silna anizotropia dyfuzji rotacyjnej.
Laboratory
of Biological
Zestawy więzów służą jako dane wejściowe dla różnych
programów (CYANA, CNS, X-PLOR).
Przykład statystyki więzów użytych do obliczenia
struktury dimerycznego białka S100A1
NOE distance constraints within subunit
intraresidual & sequential (|i-j| ≤ 1)
medium-range (1 < |i-j| < 5)
long-range (|i-j| ≥ 5)
1240
723
270
247
Intersubunit NOE distance constraints per subunit
158
Hydrogen bonds constraints
50
Restraints per residue
Restraints for calcium coordination per subunit
15.6
10
Torsion angle constraints
backbone (φ/ψ)
side chains (χ1, χ2)
67/67
0/0
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Rysunek rodziny 20 najniżej struktur dla holo-S100A1-Hcy
Nałożenie 20 struktur
po atomach głównego
łańcucha.
Struktura wstążkowa.
Zaznaczono jony Ca2+
oraz homocysteinę.
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Duże białka: 30 kDa < Mcz
znakowanie 15N/13C/2H, heterojądrowe techniki 3D i 4D.
Na razie brak sprecyzowanej strategii otrzymywania kompletnych więzów strukturalnych.
Wykorzystuje się dwa rodzaje zabiegów prowadzących do poprawy rozdzielczości.
1. Deuterowanie protonów niewymieniających się powoduje zwężenie sygnałów 13C ok. 8-krotnie;
mankament – brak przesunięć chemicznych protonów H.
Zastosowanie technik: HNCA, HN(CO)CA, HN(CA)CB, HN(COCA)CB
2. Technika TROSY wykorzystująca interferencję mechanizmów relaksacji DD i CSA jąder
amidowych 15N powoduje znaczne zwężenie sygnałów korelacyjnych 1H/15N.
białko 37 kDa 100% 1H: <T2(C)> 16 ms, <T2(HN)> 0,7 s
białko 70% 2H:
130 ms,
1,3 s
T. Yamazaki et al.,
J. Am. Chem. Soc., 116, 11655 (1994).
3. Znakowanie 15N/13C/2H z podstawieniem 1HN oraz 1H-Me w resztach Val, Leu i -Ile pozwala
zidentyfikować następujące oddziaływania NOE: HN/HN, HN/Me i Me/Me.
Do pomiarów wykorzystuje się izotopowo redagowane 4D NOESY:
15
N/15N-redagowane NOESY, 15N/13C-redagowane NOESY, 13C/13C-redagowane NOESY.
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Znakowanie izotopowe
Jednolite znakowanie 15N, 13C, 2H - ekspresja białek w:
- bakteriach (E. coli),
- drożdżach (P. pastoris),
- komórkach zainfekowanych bakulowirusem,
- pozakomórkowo.
Przy ekspresji w E. coli konieczne jest stosowanie pożywek minimalnych;
źródło 15N: sole amonowe (chlorek, azotan, siarczan),
źródło 13C: glukoza, kwas pirogronowy, octowy, bursztynowy, glicerol.
Spadek wydajności w stosunku do pełnej pożywki:
glukoza - 2x, kw. pirogronowy - 4x
źródło 2H: D2O, glicerol-2H8 w D2O.
E. coli źle rośnie w ciężkiej wodzie.
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Znakowanie izotopowe
Selektywne znakowanie wybranych grup (np. grup metylowych)
1H/13C kwas pirogronowy (jedyne źródło węgla) w D O,
2
protonowane grupy metylowe: -Leu, -Val, 2-Ile, b-Ala
~20% protonowanie Cb, powstają izotopomery CH3, CH2D, CHD2.
kwas [4-13C]--ketomasłowy: [13C1]-Ile,
kwas [4,4’-13C]--ketoizowalerianowy: [13C]-Leu, [13C]-Val.
Częściowe deuterowanie (50 – 85%)
Znakowanie segmentowe (łączenie białek - protein splicing)
domena zwana inteiną jest autokatalitycznie wycinana z powstałego białka
trans-splicing (może być kilkukrotny)
ligacja chemiczna
ograniczenia: zszycie w obszarze pętli, na złączach określone aminokwasy.
Laboratory
of Biological
Deuterowanie
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Widma 1H,15N-HSQC
Białko [2H/15H]EIN E. coli
(30 kDa).
D.S. Garret, Y.J. Seok, D.I. Liao, A. Peterkofsky, A.M. Gronenborn, G.M. Clore
Biochemistry, 36, 2517-2530 (1997).
Deuterowanie
Widma H(N)CA kalcyneuryny B (19,7 kDa):
(A) [15N/13C], HW25 Hz,
(B) [15N/13C/85%-2H] odsprzęganie 2H, HW10 Hz.
Widoczne sprzężenie skalarne 1J(CCb)35 Hz.
S. Grzesiek, J. Anglister, H. Ren, A. Bax
J. Am. Chem. Soc., 115, 4369-4370 (1993).
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Laboratory
of Biological
Selektywne znakowanie grup metylowych
[1H/13C]kwasem pirogronowym.
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Widma 1H,13C-HSQC
białka PLCC SH2
(a) 13C/1H
(b) 13C/2H /1H3C
M.K. Rosen, K.H. Gardner, R.C. Willis, W.E. Parris, T. Pawson, L.E. Kay
J. Mol. Biol., 263, 627-636 (1996).
Laboratory
of Biological
TROSY - transverse relaxation optimized spectroscopy
(15N)
1
J
N
H
1
J
N
H
1

(
H
)
1
f
(
H
)
N
1
5
f
(N
)
W sekwencji TROSY zostaje zachowana jedna, najwęższa
składowa. W efekcie następuje zmniejszenie intensywności
integralnej, ale zwiększenie wysokości sygnału.
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Laboratory
of Biological
TROSY - transverse relaxation optimized spectroscopy
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Sygnał grupy indolowej NH w tryptofanie:
(a) HSQC z odsprzęganiem w obu wymiarach,
(b) HSQC bez odsprzęgania,
(c) 15N,1H-TROSY
G. Wider, K. Wüthrich,
Curr. Opin. Struct. Biol., 9, 594-601 (1999).
Laboratory
of Biological
Deuterowanie i TROSY
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Widma HSQC (a) i TROSY (b)15N,2H- gyrazy-45 ze Staphylococcus aureus (45 kDa).
G. Wider, K. Wüthrich, Curr. Opin. Struct. Biol., 9, 594-601 (1999).
Laboratory
of Biological
Zagadnienia dotyczące NMR białek,
które nie zostały poruszone w wykładzie
Oddziaływanie białek z małymi ligandami
trNOE, trRDC.
Dynamika cząsteczkowa
magnetyczna relaksacja jądrowa, wymiana chemiczna.
Kompleksy białkowe i oligomery
filtrowanie izotopowe, techniki redagowania.
Białka paramagnetyczne.
Bałka membranowe
techniki NMR ciała stałego.
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa