Transcript Wykład prof. A. Ejcharta

Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Metody NMR stosowane w badaniach
biopolimerów
Część 1:
Wielowymiarowa spektroskopia NMR
w badaniach biologicznych
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
1.
ND NMR
2 – 3. Białka
4.
Oligonukleotydy
5.
Oligosacharydy
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Wielowymiarowa spektroskopia NMR
w badaniach biologicznych.
 Oddziaływania pomiędzy spinami jądrowymi.
 Jądrowy efekt Overhausera (NOE).
 Czasy korelacji ruchów cząsteczkowych.
 Ogólny schemat pomiaru NMR w dziedzinie czasu.
 Detekcja bezpośrednia i pośrednia - widma 2D.
 Widma wielowymiarowe.
 Rodzaje widm 2D:
widma homojądrowe i heterojądrowe,
oddziaływania spin-spin i dipolowe.
 Różnice pomiędzy widmami COSY i TOCSY.
Różnice pomiędzy widmami NOESY i ROESY.
 Przykład 1: 5'-AMP.
 Przykład 2: a-cyklodekstryna.
 Przykład 3: borneol.
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Spiny jądrowe mogą oddziaływać ze sobą:
• przez wiązania chemiczne,
• przez przestrzeń.
Oddziaływania przekazywane przez wiązania chemiczne
powodują rozszczepienia sygnałów w widmach NMR
i są charakteryzowane przez stałe sprzężenia spinowego - J.
Oddziaływania przekazywane przez przestrzeń (oddziaływania dipolowe)
wpływają na intensywności i szerokości połówkowe sygnałów
w widmach NMR.
Ważną cechą oddziaływań dipolowych jest ich zależność od odległości
pomiędzy oddziałującymi spinami ~r -6.
Laboratory
of Biological
Przykłady
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Protony H1 i H2 oddziałują
przez 3 wiązania (3JHH  8 Hz)
oraz przez przestrzeń (r  2,5 Å).
Protony H1 i H4 oddziałują
przez 5 wiązań (5JHH  0,5 Hz),
ale nie oddziałują przez przestrzeń
(r  5 Å).
Protony grupy metylowej H9
i protony pierścieniowe H5 i H6
nie są sprzężone (5JHH = 0 Hz),
ale oddziałują przez przestrzeń (2,1 < r < 4 Å).
Laboratory
of Biological
Jak można wykryć oddziaływania dipolowe ?
Jądrowy efekt Overhausera (NOE).
Zmiana natężenia sygnału spinu jądrowego A na skutek
zakłócenia stanu równowagi termodynamicznej z otoczeniem
spinu jądrowego X.
Taka zmiana pojawia się jedynie wtedy, gdy spiny A i X
oddziałują dipolowo.
NOE jest opisywany ilościowo przez współczynnik wzmocnienia
h = (Izakł - I0)/I0.
A i X są protonami
homojądrowy NOE
A lub X heterojądro
heterojądrowy NOE
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Laboratory
of Biological
Czas korelacji dla ruchu cząsteczkowego - tc.
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Dla dyfuzji rotacyjnej sztywnej cząsteczki
tc oznacza czas potrzebny do zmiany orientacji cząsteczki
o 1 radian.
Czasy korelacji definiują jedną ze skal czasów NMR.
graniczne
zwężenie
obszar przejściowy
dyfuzja
spinowa
Relacja pomiędzy wL i tc
definiuje podział na:
• obszar granicznego zwężenia,
• obszar przejściowy,
• obszar dyfuzji spinowej.
Homojądrowy NOE
h = 0 dla wLtc = 1,12
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Homojądrowy efekt Overhausera w
laboratoryjnym układzie współrzędnych - NOE,
wirującym układzie współrzędnych - ROE.
NOE zmienia znak
ROE zawsze dodatni
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Heterojądrowy NOE
Laboratory
of Biological
Schemat czasowy pomiaru NOE
Selektywne napromieniowanie sygnału spinów X
powoduje zakłócenie ich stanu równowagi.
Oddziaływanie dipolowe transmituje to zakłócenie do spinów A.
Sygnał spinów A zmienia intensywność.
Współczynnik wzmocnienia NOE: hA{X}
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Laboratory
of Biological
Przykład
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Rozróżnienie izomerów: kwas cytrakonowy
kwas mezakonowy.
widma
różnicowe
kwas mezakonowy (słaby NOE)
kwas cytrakonowy (silny NOE)
Laboratory
of Biological
Najprostszy schemat pomiaru widma NMR.
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Ten schemat można w ogólny sposób podzielić na dwa etapy.
przygotowanie
detekcja
Przygotowanie - wytworzenie nierównowagowego stanu układu spinowego.
Detekcja - rejestracja sygnału swobodnej precesji (FID) podczas powrotu
układu spinowego do stanu równowagowego. Taki sygnał zawiera informacje
o położeniach, kształtach i intensywnościach sygnałów.
Sygnał FID jest funkcją czasu ta i dopiero operacja FT przetwarza go na funkcję częstości.
Laboratory
of Biological
Pomiar NOE
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Bardziej złożony etap przygotowania.
przygotowanie
rejestracja
Ten ogólny schemat można rozszerzyć.
Laboratory
of Biological
Pomiar ROE
przygotowanie mieszanie rejestracja
Pomiędzy etapami przygotowania i rejestracji
można umieścić etap mieszania.
Mieszanie - zmiana stanów różnych spinów jądrowych
na skutek oddziaływań spinowych lub dipolowych.
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Do tego momentu omawialiśmy widma NMR,
w których częstości rezonansowe jąder
były rejestrowane bezpośrednio.
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Jednak po etapie przygotowania spiny jądrowe
będą wykonywały precesję z charakterystycznymi dla siebie
częstościami niezależnie od tego czy będziemy rejestrować
sygnał FID czy też nie.
Rozszerzenie schematu:
przygotowanie (td) - mieszanie (tm) - rejestracja (ta)
na:
przygotowanie (td) - ewolucja (t1) - mieszanie (tm) - rejestracja (t2)
stwarza nową jakość w spektroskopii - widma dwuwymiarowe (2D).
Podczas ewolucji (podobnie jak podczas rejestracji) spiny precesują
ze swoimi charakterystycznymi częstościami.
Laboratory
of Biological
Wielokrotne wykonanie pomiaru, w którym jedyna zmiana
polega na zwiększaniu w stały sposób czasu ewolucji powoduje,
że na początku czasu mieszania w każdym z pomiarów układ spinów
znajduje się w innym stanie, co powoduje zmiany faz
i intensywności sygnałów.
W tych zmianach zakodowana jest informacja o częstościach spinów.
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
t1=t0+3D
t
t1=t0+2D
t
t1=t0+Dt
t1=t0
Odpowiednie sekwencje pomiarowe pozwalają wybrać podczas etapu mieszania
przekazywanie korelacji przez oddziaływania spinowe lub dipolowe.
Laboratory
of Biological
Koncepcję pomiaru widm 2D można dalej rozszerzyć
na widma 3D czy 4D.
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
1D: (td) - (ta)
32·2s=64s
2D: (td) - [(t1) - (tm)] - (t2)
512·16·2s4,5h
3D: (td) - [(t1) - (tm1)] - [(t2) - (tm2)] - (t3)
64·128·4·2s18h
4D: (td) - [(t1) - (tm1)] - [(t2) - (tm2)] - [(t3) - (tm3)] - (t4)
Zwiększanie liczby wymiarów ma swoją cenę,
ogromne wydłużenie czasu pomiaru
i pogorszenie rozdzielczości w widmie.
32·32·64·2·2s3d
Widma homojądrowe:
częstości tego samego izotopu na obu osiach.
Sygnały diagonalne (f1 = f2) i sygnały korelacyjne (f1  f2).
Widma heterojądrowe
częstości różnych izotopów na osiach.
Tylko sygnały korelacyjne.
Detekcja protonowa
charakteryzuje się
znacznie lepszą
czułością niż
detekcja heterojądrowa.
HSQC lepsze niż HETCOR
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Laboratory
of Biological
Homojądrowe widma 2D:
COSY - korelacje przez homojądrowe sprzężenia spinowe,
TOCSY - korelacje przez homojądrowe sprzężenia spinowe
w całym układzie spinowym,
NOESY - korelacje przez oddziaływania dipolowe
w laboratoryjnym układzie współrzędnych,
EXSY - korelacje przez powolną wymianę chemiczną
w laboratoryjnym układzie współrzędnych,
ROESY - korelacje przez oddziaływania dipolowe
w wirującym układzie współrzędnych.
Heterojądrowe widma 2D:
HSQC - korelacje przez heterojądrowe sprzężenia spinowe
przez 1 wiązanie,
HMBC - korelacje przez heterojądrowe sprzężenia spinowe
dalekiego zasięgu (przez więcej niż 1 wiązanie).
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Różnica pomiędzy COSY i TOCSY
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Schematyczne położenie sygnałów
w widmach COSY i TOCSY
układu spinowego kwasu
N-acetyloglutaminowego:
CH3CONHCH(COOH)CH2CH2COOH.
TOCSY dobrze sprawdza się
w układach liniowych, ale
w układach cyklicznych
widma COSY dostarczają
bardziej jednoznacznych
informacji.
Struktura subtelna sygnałów korelacyjnych w widmach COSY
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Struktura sygnału korelacyjnego HA/HB
H
wAczterospinowym
/HB
układzie ABCD,
w
w czterospinowym
którym proton HAukładzie
jest sprzężony
ABCD,z
w
pozostałymi
którym proton
protonami.
HA jest sprzężony z
pozostałymi
JAB - aktywnaprotonami.
stała sprzężenia,
stała stałe
sprzężenia,
JAB
sprzężenia.
AC,-Jaktywna
AD - pasywne
JAC, JAD - pasywne stałe sprzężenia.
Aktywna (w antyfazie)
i pasywna (w fazie)
stała sprzężenia spinowego.
Mała wartość aktywnej stałej sprzężenia
osłabia intensywność sygnału korelacyjnego
w widmie COSY.
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
W widmach TOCSY składowe
sygnałów korelacyjnych mają
zgodne fazy i dlatego niezależnie
od wielkości aktywnej stałej sprzężenia
nie ulegają osłabieniu.
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Widma NOESY, ROESY i EXSY
Relacja faz sygnałów diagonalnych i korelacyjnych
Laboratoryjny układ współrzędnych (NOESY/EXSY)
obszar granicznego zwężenia:
oddz. dipolowe - przeciwna
wymiana chem. - zgodna
obszar dyfuzji spinowej:
oddz. dipolowe - zgodna
wymiana chem. - zgodna
Wirujący układ współrzędnych (ROESY)
niezależnie od czasu korelacji:
oddz. dipolowe - przeciwna
wymiana chem. - zgodna
Przykład 1.
5'-AMP
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
5'-monofosforan adenozyny
HDO
H8
H2
H1'
Jednowymiarowe (1D) widmo 1H NMR
5'-AMP
Widmo 2D COSY
H4'
H2'
H1'
H5'5''
H3'
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
5'-AMP
2D 1H/13C HSQC
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
H3'
H8
H2
H1'
H2'
H4'
H5’5’’
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Przykład 2.
a-cyklodekstryna
cykliczny związek zbudowany z 6 glukoz
Związek ma oś symetrii C6, więc odpowiednie protony we wszystkich
glukozach są homotopowe i dlatego mają tę samą wartość przesunięcia
chemicznego, np. 6 protonów H1 czy 6 protonów H2.
Laboratory
of Biological
a-cyklodekstryna
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Jednowymiarowe (1D) widmo 1H NMR
H1
HDO
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
H3/H4
H1/H2
H2/H3
H4/H5
a-cyklodekstryna
H1
Widmo 2D
COSY
Laboratory
of Biological
a-cyklodekstryna
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Jednowymiarowe (1D) widmo 1H NMR
H6,6'
H1
H2
H3
HDO
H5
H4
Laboratory
of Biological
a-cyklodekstryna
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Jednowymiarowe (1D) widmo 13C NMR
Intensywności w widmie są zakłócone !
C1
C6
H6,6'
Laboratory
of Biological
H1
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
H2
H3
H4
H5
C6
C3
C5
C2
C4
2D 1H/13C HSQC
C1
Laboratory
of Biological
a-cyklodekstryna
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
C5
C2
C1
C4
C6
C3
Przykład 3.
Laboratory
of Biological
borneol
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
bicykliczny monoterpen
Jednowymiarowe (1D) widmo 1H NMR
aceton
3 x Me
Zaznaczone przypisania otrzymano z analizy widma COSY,
w którym jednak brak korelacji do grup metylowych.
5X, 6N
2
3X
4
5N
6X
3N
Przesłanką do identyfikacji grupy Me10 mogą być
intensywności sygnałów metylowych.
Małe (4J<0,5 Hz) sprzężenia spinowe przez 4 wiązania.
Me8: 3·H9+H4 - 4 protony,
Me9: 3·H8+H4 - 4 protony,
Me10: H2+2·H6 - 3 protony, większa intensywność.
A B
C
borneol
Me10 ?
3N
Laboratory
of Biological
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Laboratory
of Biological
borneol
widmo 2D NOESY
6X/6N
5N/5X
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
Laboratory
of Biological
borneol
Instituteof BiochemistryandBiophysics, Warszawa
widmo 2D NOESY - rozciągnięcie
2
Oczekiwane korelacje
2: Me8, Me10
3X: Me8, 3N
5X: Me9
4: Me8, Me9, 3N
6X: Me9, Me10
3X
Korelacje widoczne
2: A, B, C
3X: A, B, 3N
5X: A
4: A, B, 3N
6X: A, B, C
5X
4
6X
Wnioski:
5X/A:
A=Me9
4/(A,B,3N) oraz
3X/(A,B,3N): B=Me8
korelacje do 2 i 6X
potwierdzają, że C=Me10