Transcript wyklad 2-online

Podsumowanie - wykład 2
1. Struktura kwasów nukleinowych ( DNA i RNA)
2. Dwuniciowa helisa DNA ( typy helis DNA)
3. Rodzaje i funkcje RNA (podział funkcyjny; wielkość
cząsteczek)
4. Właściwości kwasów nukleinowych
- stabilność, wpływ niskiego i wysokiego pH, denaturacja
chemiczna, denaturacja termiczna, gęstość)
5. Metody izolacji kwasów nukleinowych (założenia i etapy)
6. CTAB dla DNA, TRIZOL (TRI) dla RNA; zestawy komercyjne
7. Ocena stopnia czystości i ilości preparatów DNA i RNA
- Pomiary spektrofotometryczne
- Elektroforeza w żelu agarozowym;
TYPY HELIS DNA
Forma B - DNA – prawoskrętna, zidentyfikowana przez Watsona i
Cricka występuje in vivo w każdym DNA;
Dwuniciowe
helisy A, B, Z
Forma A - DNA – prawoskrętna, powstaje w warunkach niskiej
wilgotności, jej struktura jest szersza i krótsza niż formy B in vivo
hybrydach DNA-RNA
Forma Z - DNA – lewoskrętna, powstaje w dwuniciowym DNA, w
którym zasady pirymidynowe i purynowe występują po sobie na
przemian np. CGCGCG; w normalnym DNA tworzy się b. rzadko.
A
B
IZOLACJA CAŁKOWITEGO DNA
1. Izolacja DNA z zastosowaniem
fenolu i chloroformu;
2. Izolacja z wysoleniem białek
3. Izolacja poprzez związanie z
nośnikiem, odmycie
zanieczyszczeń i uwolnienie DNA (
zestawy komercyjne – izolacja
DNA na kolumienkach)
ETAPY IZOLACJI DNA
1. Fizyczne
zniszczenie
struktury
tkankowej
i komórkowej
materiału biologicznego, tzw. homogenizacja.
2. Uwolnienie DNA - DNA chroniony jest w komórce w różnych
błonowych strukturach subkomórkowych, takich jak np.: jądro,
mitochondria. W celu degradacji błon komórkowych i białek, do
buforów ekstrakcyjnych dodawane są różne detergenty.
3. Usunięcie zdegradowanych elementów komórkowych.
4. Oddzielenie DNA (wytrącanie) od związków użytych na
wcześniejszych etapach izolacji, (detergentów, soli).
5. Przygotowanie DNA do przechowywania.
IZOLACJA CAŁKOWITEGO RNA
ZASADA: Izotiocyjanian guanidyny należy do substancji najefektywniej
denaturujących białka. Jest on także silnym inhibitorem rybonukleaz. Metoda ta
opiera się na ekstrakcji izotiocyjaninem guanidyny i mieszaniną
fenol/chloroform w środowisku kwasowym.
Czystość preparatów DNA i RNA
Czystość preparatów DNA i RNA można określić obliczając stosunek: A260/A280nm;
Czysty DNA ma A260/A280 nm= 1.8; czysty RNA = 2.0;
Wartość A260/A280 = 1.5 oznacza zanieczyszczenie białkiem w około 50 %.
Elektroforeza w żelu agarozowym
Agaroza
Polisacharyd oczyszczany z glonów morskich (krasnorostów);
Właściwości agarozy / żelu agarozowego:
-transparentność –dobrze widoczne rozdzielane fragmenty
- brak obecności DNaz /RNaz
- niski punkt topnienia
- wysoka wytrzymałość żelu
- wysoka rozdzielczość produktów PCR oraz fragmentów
DNA w zakresie 100 -10 000 pz( szeroki zakres stężeń)
- bardzo niskie tło fluorescencji przy barwieniu bromkiem etydyny