Transcript oligonukleotydy antysensowne (aso)

OLIGONUKLEOTYDY ANTYSENSOWNE (ASO)
Syntetyczne lub syntezowane in vivo oligonukleotydy (rybo- i
deoksyrybonukleotydy) liczące około 20 nukleotydów, których sekwencja jest
komplementarna do mRNA wyciszanego genu
NIĆ SENSOWNA
OLIGONUKLEOTYDY ANTYSENSOWNE działają na różnych poziomach
Uważa się, że stabilność kompleksów RNA:RNA jest większa niż
dupleksów RNA:DNA lub DNA:DNA
OLIGONUKLEOTYDY ANTYSENSOWNE hamują translację na 2
sposoby:
1. blokowanie działania rybosomów
2. inicjacja RNAzyH degradującej kompleksy DNA:RNA
Działania niespecyficzne:
1. Degradacja RNA powoduje powstawanie dużych ilości dGMP i dAMP
2. ciąg 4 reszt guaninowych hamuje proliferację
3. hamowanie proliferacji przez szkielet polianionowy (wiązanie białek
zasadowych na powierzchni komórek – hamowanie wiązania mitogenów)
4. inhibicja PKC – kinazy białkowej C
OLIGONUKLEOTYDY ANTYSENSOWNE – kryteria
strukturalne do projektowania:
1. długość: 12-25 nt
 krótkie są mało specyficzne
 długie – słabo rozpuszczalne, trudniej się wprowadza,
mogą tworzyć struktury 2 i 3-rzędowe
2. skuteczność dla końca 5’ większa
 fragmenty 3’ mRNA mogą tworzyć struktury 2 i 3rzędowe
 fragmenty 3’ mRNA są opłaszczone białkami
3. modyfikacje chemiczne które pozwalają zwiększyć
stabilność oligonukleotydów w komórce oraz zwiększyć ich
wchłanianie
MODYFIKACJE:
 rybozy (wodór w pozycji 2’ na gr. metylową lub tlen 3’ na
gr. aminową)
 zasada azotowa
 wiązanie fosforowe
WŁAŚCIWOŚCI MODYFIKACJI WIĄZANIA FOSFODIESTROWEGO:
rozpuszcz
alność
stabilność
transport
do komórki
DNA
polarny,
dobra
niestabilny
wolny
degradacja
przez
RNAzęH
metylofosfoniany
niepolarny,
zła
stabilny
dobry
niepodatny
na RNAzęH
wymaga
dużych
stężeń
fosfotioniany
polarny,
dobra
stabilny
b. wolny
degradacja
przez
RNAzęH
działanie
niespecyf
iczne,
stereoizo
mery
typ modyfikacji
działanie
uwagi
OLIGONUKLEOTYDY ANTYSENSOWNE – kryteria dla projektowania:
1. Kryteria strukturalne:
• brak komplementarności z innymi sekwencjami mRNA niż badana
• wiązanie do rejonu 5’ mRNA
• unikanie motywów indukujących mechanizmy odpowiedzi
immunologicznej w komórce (4-krotne powtórzenia GGGG, sekwencje
palindromowe o długości > 6 nukleotydów, motywy CG).
2. Kryteria termodynamiczne (wartość ΔG (energia swobodna)):
• tworzenie stabilnych hybryd ASO-mRNA (ΔG37 < -30 kcal/mol)
• niski potencjał tworzenia połączeń (dimerów) między cząsteczkami
ASO (ΔG37 > -8 kcal/mol)
• unikanie możliwości tworzenia wewnętrznych struktur drugorzędowych
w cząsteczkach ASO (ΔG37 > -1,1 kcal/mol)