Transcript „Oocyte-specific expression of Gpr3 is required for maintenance of

„Oocyte-specific expression of Gpr3 is required
for maintenance of meiotic arrest in mouse
oocytes.”
Lisa M.Mehlmann
„Ekspresja Gpr3 w oocycie jest
wymagana do utrzymania bloku
mejotycznego w oocytach myszy”
Monika Ostrowska
Oocyty
• oocyt+komórki pęcherzykowe= pęcherzyk jajnikowy
• Oocyty zatrzymane są w profazie I
• utrzymanie profazy zależy od wysokiego poziomu cAMP
• oocyty,które zakończyły okres wzrostu i zasiedlają duże
pęcherzyki z formującą się jamką nabywają zdolność do
zapłodnienia
• wznawiają mejozę w odpowiedzi na wyrzut hormonu LH..
• LUB zrobią to samorzutnie jeśli usunie się je z pęcherzyka
jajnikowego
Jak powstaje cAMP?
?
• Receptor GPR3 stymuluje
białko Gs
• aktywne białko Gs stymuluje
cyklazę adenylową
• aktywność cyklazy adenylowej
powoduje wzrost cAMP
• cAMP aktywuje kinazę A
• ...ciąg przekazywania
informacji..
• hamowanie kompleksu cyklinaB
-CDK1
• oocyt utrzymany w profazie I
Co wiemy o GPR3..
• Jest receptorem połączonym z białkiem Gs
• ekspresja Gpr3 mRNA zachodzi zwłaszcza w
oocycie, ALE także,choć na niższym poziomie, w
otaczających go komórkach pęcherzykowych
(GPR3 jest zlokalizowane w oocycie, ale także
prezentowane wszędzie w pęcherzyku)
• Odpowiedzialny za produkcje cAMP w oocycie (co
najmniej w dużej części)
GPR3 w oocycie czy w otaczających go
komórkach pęcherzykowych jest
niezbędny do utrzymania bloku
mejotycznego w oocycie?
Interferencja RNA
• Do oocytów w pęcherzykach
jajnikowych wstrzyknięto
małe dwuniciowe
interferujące RNA- siRNA
• RNA było skierowane
przeciwko Gpr3
• zapoczątkowało to
sekwencjo-specyficzną
degradację mRNA
• cel: redukcja mRNA
kodującego Gpr3 w oocytach
Doświadczenie I
Mikroiniekcja siRNA nakierowanego na Gpr3 do oocytów
otoczonych pęcherzykiem
• Grupy: - 50nM Gpr3 siRNA
- 5nM Gpr3 siRNA
- 100nM mutGpr3 siRNA
- 100nM GAPDH siRNA
- kontrola- bez mikroiniekcji
• oocyty w pęcherzykach bez jamki (140-180mikrom
średnicy)
• czas hodowli 3dni
• izolacja,podział na GV i GVBD, liczenie
Wyniki
GVBD :
• kontrola
- 2%
• 5nM Gpr3 siRNA - 15%
•50nM Gpr3 siRNA - 67%
• mutGpr3 siRNA - 5%
• GAPDH siRNA - 0%
•64% oocytów GVBD z
Gpr3 siRNA wyrzuciło
ciałko kierunkowe
Wnioski
• redukcja Gpr3 RNA w obrębie mysiego oocytu
powoduje wznowienie mejozy
• wznowienie podziału mejotycznego w oocytach z Gpr3
siRNA było dozo-zależne
Doświadczenie II
RT-PCR
• Grupy oocytów: - z Gpr3 siRNA
- kontrolna
- mutGpr3 siRNA
• przygotowane jednakowe ilości cDNA
• startery nakierowane przeciwko : Gpr3 i rybosomalnego
białka L19 – Rpl19
Wyniki
• Wstrzykniecie Gpr3
siRNA zmniejszyło ilość
Gpr3 mRNA do 10 % w
stosunku do obecnego w
oocytach kontrolnych.
•
Ilość Rpl 19 mRNAniezmieniona.
•
mutGpr3 siRNA nie
zmniejszyło ilości Gpr3
mRNA
Wnioski
• RNAi nakierowane na Gpr3 jest specyficzne.
• Mikroiniekcja Gpr3 siRNA powoduje skuteczną redukcje
Gpr 3 RNA w oocytach w pęcherzykach jajnikowych u
myszy.
Doświadczenie III
Mikroiniekcja siRNA nakierowanego na Gpr3 do
oocytów izolowanych/ RT-PCR
• Grupy oocytów: - 50nM Gpr3 siRNA
- kontrola
• hodowano w obecności 4nM hypoksantyny, przez 26-45h
• izolacja,podział na GV i GVBD, liczenie
• RT-PCR jak poprzednio
Wyniki
• 16% izolowanych oocytów
wznowiło mejozę
< jest to znacznie mniej w
porównaniu z 67% w
pęcherzykach>
• redukcja Gpr3 mRNA
mniejsza niż u oocytów w
pęcherzykach
Wnioski
• RNAi powoduje wznowienie mejozy i redukcję Gpr3
mRNA w izolowanych oocytach ale w mniejszym
stopniu niż w zamkniętych w pęcherzykach oocytach
•
RNAi jest bardziej efektywna w oocytach otoczonych
pęcherzykiem
• ograniczony czas hodowli oocytów wyizolowanych- nie
wystarczający do obniżenia ilości białka Gpr3 wcześniejistniejącego i efektywnego zredukowania mRNA
Powiązanie z poprzednimi doświadczeniami
• 70% GVBD obserwowanych po iniekcji siRNA do
oocytu to bardzo blisko do 80-90% zaobserwowanych
przy usunięciu Gpr3 RNA z zarówno oocytu jak i komórek
pęcherzykowych u myszy z knockout-em Gpr3
• zdolność do utrzymania profazy I w oocycie u myszy z
knockout-em Gpr3 może być uratowana jeśli
przeprowadzimy mikroiniekcję RNA kodującego Gpr3 do
oocytu otoczonego pęcherzykiem
Podsumowanie
• Redukcja GPR3 specyficznie w oocycie otoczonym
pęcherzykiem powoduje wznowienie mejozy
• utrzymanie bliku mejotycznego jest zależne od
obecności GPR3 w oocycie
• metoda redukcji RNA w pęcherzykach jajnikowych, które
mogą być hodowane przez czas wystarczający do redukcji
endogenicznych białek, powinna znaleźć zastosowanie w
stosunku do wielu innych białek, które mogą być
zaangażowane w zatrzymanie mejozy, wznowienie mejozy,
zapłodnienie czy wczesny rozwój zarodkowy
Podsumowanie cz.2
• Jest możliwe, że komórki pęcherzykowe mogą
produkować cAMP i dostarczać go przez „gap junctions”
do oocytu ...ALE ilość produkowanego przez nie cAMP
jest niewystarczająca do utrzymania stanu zatrzymania
mejozy-za to odpowiada cAMP produkowane przez oocyt
• mimo to oocyt oddzielony od pęcherzyka spontanicznie
wznawia mejozę...dlaczego?
Hipoteza: komórki pęchrzykowe wysyłają
sygnały pobudzające Gpr3 do aktywności.
(hipoteza niepotwierdzona)
Dziękuje za uwagę