Transcript Świat RNA

Świat małych RNA
www.plantcell.org/cgi/doi/10.1105/tpc.110.tt0210
Czym są małe RNA?
•Małe RNA to populacja cząsteczek RNA o długości
21 to 24 nt, które generalnie powodują wyciszanie
genów (gene silencing)
•Małe RNA przyczyniają się do potranskrypcyjnego
wyciszania genów (post-transcriptional gene
silencing-PTGS) poprzez negatywne działanie na
translację lub stabilność mRNA
AAAAA
•Małe RNA przyczyniają się do transkrypcyjnego
wyciszania genów (transcriptional gene silencingTGS) poprzez epigenetyczne modyfikacje
chromatyny
RNA Pol
Modyfikacje histonów, metylacja DNA
Podstawa wyciszania przez RNA –
białka Dicer i Argonaute
Wyciszanie przez RNA
opiera się na dwóch
podstawowych reakcjach:
a) Dwuniciowy RNA (dsRNA) jest
rozcinany przez Dicer i jego
homologi na krótkie dwuniciowe
RNA.
b) Te małe RNA asocjują następnie
z białkami rodziny ARGONAUTE i
powodują wyciszenie.
AGO
Silencing
Dicer i białka podobne do Dicer
W biogenezie siRNA i miRNA, Dicer lub
białka podobne do Dicer (Dicer-like – DCL
proteins) rozcinają dsRNA lub RNA ze
spinką (hairpin) na fragmenty ~ 21 – 25 nt.
Struktura Dicer’a pozwala mu „mierzyć” RNA,
który rozcina. Podobnie jak kucharz szatkujący
marchewkę, Dicer tnie RNA na równe
fragmenty.
From MacRae, I.J., Zhou, K., Li, F., Repic, A., Brooks, A.N., Cande, W.., Adams, P.D., and Doudna, J.A. (2006) Structural basis for
double-stranded RNA processing by Dicer. Science 311: 195 -198. Reprinted with permission from AAAS. Photo credit: Heidi
Białka Argonaute
Białka ARGONAUTE wiążą
małe RNA i ich cele
Mutant Arabidopsis ago1 i
ośmiornica Argonauta argo
Białka ARGONAUTE nazwano
tak ze względu na wygląd
mutanta Arabidopsis
argonaute1 ; ago1 ma
promieniście rozłożone liście
przez co przypomina
ośmiornicę o nazwie
Argonauta.
Reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd: EMBO J. Bohmert, K., Camus,
I., Bellini, C., Bouchez, D., Caboche, M., and Benning, C. (1998) AGO1 defines
a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development. EMBO J. 17: 170–180. Copyright 1998; Reprinted from Song, J.-J., Smith, S.K., Hannon, G.J., and Joshua-Tor,
L. (2004) Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science 305: 1434 – 1437. with permission of AAAS.
Wyciszanie przez RNA – obraz ogólny
siRNA-
działa
AGO
poprzez
potranskrypcyjne i
transkrypcyjne
wyciszanie genów
AGO
RNA Pol
MicroRNA –
działa poprzez
wyciszanie mRNA
i represję
translacji
MIR gene
RNA Pol
AGO
AAAn
AGO
AGO
AAAn
AAAn
mRNA
RNA Pol
siRNA – Ochrona genomu
siRNA chronią genom poprzez:
• Supresję atakujących komórkę wirusów
• Wyciszanie źródeł wadliwych transkryptów
• Wyciszanie transpozonów i elementów
powtarzających się
Oprócz tego, siRNA utrzymują niektóre geny
w stanie epigenetycznie wyciszonym
Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: Nature. Lam, E., Kato , N., and Lawton, M. (2001)
Programmed cell death, mitochondria and the plant hypersensitive response. Nature 411: 848-853. Copyright 2001.
Wyciszanie genów indukowane
przez wirusy – obraz ogólny
Kodowana przez
wirusa RNAzależna RNA
polimeraza
Wirusowy ssRNA
Większość wirusów
roślin to RNA wirusy,
które replikują się
poprzez dwuniciowe
formy pośrednie.
Wirusowy dsRNA
Dwuniciowy RNA jest
rozcinany przez DCL
wytwarzając siRNA,
które asocjują z AGO
wyciszając replikację i
ekspresję wirusa.
AGO
AGO
Rośliny mogą obronić się przed
infekcją wirusem i nabyć oporności
Najmłodsze
Najstarsze
Inokulacja
wirusem
Młodsze liście
wytwarzane przez roślinę
zakażoną wirusem mogą
być pozbawione infekcji,
co wskazuje, że rosnąca
roślina obroniła się przed
infekcją.
Małe RNA korelują z indukowanym przez infekcję
wirusem wyciszeniem genów
Mały RNA homologiczny do
wirusowego RNA występuje w
liściachinokulowanych i
odległych młodych liściach
(systemic leaf), ale nie w liściach
inokulowanych roztworem bez
wirusa (mock),
Młody liść
(syst.leaf)
Dni po
inokulacji
Inokulowany liść
From Ratcliff, F., Henderson, B.D., and Baulcombe, D.C. (1997) A similarity between viral defense and
gene silencing in plants. Science 276: 1558–1560. Reprinted with permission from AAAS.
Infekcja wirusem powoduje
systemiczną akumulację siRNA
Odległy
liść
Liść
inokulowany
Wyciszenie może się
rozprzestrzeniać systemicznie
poprzez floem
Systemiczne
wyciszenie
Inokulowany liść
Sygnałem systemicznym jest
siRNA
Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: Nature Copyright 1997. Voinnet, O.,
and Baulcombe, D. (1997) Systemic silencing in gene silencing. Nature 389: 553.
Mutanty w wytwarzaniu siRNA są bardziej podatne na
infekcje wirusowe
Dzikie rośliny Arabidopsis
inokulowane TRV
Podwójny mutant dcl2dcl4 inokulowany TRV
Wyciszanie wirusa
TRV w dzikich
roślinach Arabidopsis
zapobiega
występowaniu
symptomów choroby.
Mutanty pozbawione
aktywności Dicer są
niezdolne do
powstrzymania
infekcji.
From Deleris, A., Gallego-Bartolome, J., Bao, J., Kasschau, K., Carrington, J.C., and Voinnet, O. (2006) Hierarchical action and
inhibition of plant dicer-like proteins in antiviral defense. Science 313: 68–71. Reprinted with permission from AAAS.
Wirusy maja białka supresorowe, które zapobiegają
wyciszeniu RNA
RdRP
Poprzez zakłócenie procesu
wyciszania RNA wirusowe białka
supresorowe zakłócają mechanizm
obrony rośliny przed wirusami.
Supresory mogą działać na każdym
etapie wytwarzania i funkcjonowania
siRNA.
Małe RNA chronią także rośliny
przed patogenami bakteryjnymi
Rośliny dzikie (La-er) i mutanty w
wytwarzaniu małych RNA (dcl1-9 and hen11) inokulowane bakteriami Pseudomonas.
Reprinted from Navarro, L., Jay, F., Nomura, K., He, S.Y., and Voinnet, O. (2008) Suppression of the microRNA
pathway by bacterial effector proteins. (2008) Science 321: 964-967. Reprinted with permission from AAAS.
Wyciszanie indukowane przez
wirusy - podsumowanie
• Wyciszanie genów za pośrednictwem RNA jest ważnym
narzędziem w obronie roślin przed patogenami.
• siRNA zakłócają replikację wirusów.
• siRNA działają systemicznie wspomagając obronę przed
wirusami i oporność roślin.
• Większość wirusów wytwarza białka supresorowe
procesu wyciszania RNA. Białka te stanowią ważne
narzędzie w badaniu szlaków wyciszania RNA.
Wyciszanie transgenów
• Transgeny wprowadzone do roślin są często wyciszane
przez szlak siRNA.
• Wyciszenie może być zaindukowane przez:
• Bardzo wysoki poziom ekspresji
• dsRNA pochdzące z transgenu
• Nietypowe RNA kodowane przez transgen
• Transgeny są wyciszane potranskrypcyjnie i
transkrypcyjnie.
Wyciszanie indukowane przez
transgeny
W latach 1980-tych opracowano
metodę wprowadzania genów do
genomów roślinnych za pomocą
bakterii Agrobacterium
tumefaciens. Wprowadzone geny
noszą nazwe transgenów.
Komórka roślinna
Jądro
DNA
Agrobacterium
tumefaciens na
powierzchni komórki
Photo credits: Martha Hawes, University of Arizona.
Indukowane przez transgeny
wyciszanie potranskrypcyjne
Doświadczenia nad
modyfikacją koloru kwiatów
petuni dostarczyły pierwszych
dowodów na wyciszanie RNA.
Manipulacje ekspresją syntazy chalkonowej w celu modyfikacji
pigmentacji kwiatów
Syntaza
chalkonow
a (CHS)
Dzika roślina petuni
wytwarza
purpurowe barwniki
antocjanowe
Syntaza chalkonowa
(CHS) jest enzymem
działającym na początku
szlaku syntezy antocjanów
Antocjany
Photo credit Richard Jorgensen; Aksamit-Stachurska et al. BMC Biotechnology 2008 8:25 doi:10.1186/1472-6750-8-25
Spodziewane – produkcja sensownego RNA syntazy
chalkonowej (CHS) zwiększy pigmentację...
Gen własny
Translacja białka
mRNA
PRO
ORF
Transgen
Sense construct:
PRO
ORF
mRNA
Dodatkowa translacja białka
Sensowny RNA
mRNA
mRNA
..a produkcja antysensownego RNA zablokuje
pigmentację
Translacja białka
Gen wlasny
mRNA
PRO
ORF
Transgen
Konstrukt sensowny:
PRO
mRNA
Dodatkowa translacja białka
Sensowny RNA
ORF
mRNA
mRNA
Transgen
Konstrukt antysensowny:
ORF
PRO
Antysensow
ny RNA
Tworzy się dupleks sens-antysens,
który hamuje translację
Nieoczekiwanie, zarówno antysensowny jak i
sensowny konstrukt hamował wytwarzanie pigmentu
Rośliny z transgenem CHS
Sens
OR
CaMV 35S pro :
CHS
CaMV 35S pro : CHS
Antysens
Photo credit Richard Jorgensen
Wyciszone tkanki nie wyrażają ani własnego ani
wprowadzonego genu CHS
Purpurow
e kwiaty
Białe
kwiaty
To zjawisko, w którym zarówno
wprowadzony, jak i własny gen
ulegają wyciszeniu, nazwano
kosupresją.
RNA transgenu
RNA
własnego
genu
Napoli, C., Lemieux, C., and Jorgensen, R. (1990) Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into
petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans. Plant Cell 2: 279–289.
Kosupresja jest rezultatem
wytwarzania siRNA
Translacja białka
Dzika
mRNA
PRO
ORF
mRNA
Własny gen
Transgeniczna z kosupresją
PRO
ORF
Kosupresja
Sens RNA
Sense construct
PRO
Własny gen
ORF
siRNA jest
wytwarzany
mRNA
De Paoli, E., Dorantes-Acosta, A., Zhai, J., Accerbi, M., Jeong, D.-H., Park, S., Meyers, B.C., Jorgensen, R.A., and
Green, P.J. (2009). Distinct extremely abundant siRNAs associated with cosuppression in petunia. RNA 15: 1965–1970.
Najsilniejszym induktorem wyciszania RNA jest
dwuniciowy RNA, co wykazano w badaniach na C.
elegans
Sensowny,
antysensowny i
dwuniciowy RNA
homologiczny do genu
unc-22 wprowadzono do
C. elegans. Wyciszenie
unc-22 powoduje utrate
kontroli nad mięśniami,
stąd nazwa unc od
ang.“uncoordinated”.
Senowny RNA Antysensowny RNA
Brak efektu
Brak efektu
Dwuniciowy RNA
Nieskoordynowane skurcze
Derived The Nobel Committee based on Fire, A. et al., (1998) Potent and specific genetic
interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391: 806-811.
Transkrypcyjne wyciszanie genów
Małe RNA mogą inicjować wyciszanie DNA poprzez
kowalencyjne modyfikacje DNA lub zasocjowanych z
nim histonów, zakłócając w ten sposób transkrypcję.
Transkrypcja
Białka
histonowe
DNA
Wyciszanie
Ta forma wyciszania
występuje często na
stabilnie wyciszonym
DNA i dotyczy np.
centromerów i
transpozonów, ale
niekiedy dotyczy także
genów.
Transkrypcyjne wyciszanie genów
CaMV 35S pro : KAN
Ekspresja genu, który
niesie oporność na
antybiotyk kanamycynę
Transkrypcyjne
wyciszanie genów
ujawniły
doświadczenia, w
których do roślin
poprzez krzyżówki
genetyczne
wprowadzono
więcej niż jeden
transgen.
CaMV 35S pro : HYG
Ekspresja genu, który
niesie oporność na
antybiotyk higromycynę
Based on Matzke, M., Primig, M., Trnovsky, J., Matzke, A. (1989) Reversible methylation and
inactivation of marker genes in sequentially transformed plants. EMBO J. 8: 643-649.
siRNA mogą wskazywać DNA do wyciszenia poprzez
metylację cytozyny lub za pośrednictwem enzymów
modyfikujących histony
NH2
N
O
NH2
CH3
N
N
~
cytozyna
O
N
~
Dokładne mechanizmy, za pomocą których
siRNA wskazują DNA do wyciszenia nie są
znane, ale wiadomo, że wymagają działania
dwóch specyficznych dla roślin kompleksów
RNA-polimeraz: RNA Polimerazy IV (Pol IV)
i RNA Polimerazy V (Pol V).
5-metylocytozyna
DNA może być
kowalencyjnie
modyfikowany przez
metylację cytozyny
dokonywaną przez DNAmetylotransferazy .
DNA
methyltransferase
Modyfikacja histonów
Metylacja DNA
Rośliny zawierają dodatkowe kompleksy RNA
polimeraz, które biorą udział w wyciszaniu
RNA
RNA
Polimeraza
DNA
Kompleks
Występowanie
Funkcja
RNA Polimeraza I
Wszystkie eukariota
Produkcja rRNA
RNA Polimeraza II
Wszystkie eukariota
Produkcja mRNA, microRNA
RNA Polimeraza III
Wszystkie eukariota
Produkcja tRNA, 5S rRNA
RNA Polimeraza IV
Rośliny lądowe
Produkcja siRNA
RNA Polimeraza V
Rośliny nasienne
Rekrutacja AGO do DNA
Większość siRNAs wytwarzana jest z
transpozonów i powtarzalnego DNA
Chromosom
Centromer
Ilość małych
RNA
Ilość
transpozonów/
retrotranspozonó
w
Większość komórkowych siRNA pochodzi z transpozonów i innych powtarzalnych
sekwencji. U Arabidopsis, (schemat powyżej) sekwencje te występują z wielką
częstością w pericentromerycznych rejonach chromosomów.
Kasschau, K.D., Fahlgren, N., Chapman, E.J., Sullivan, C.M., Cumbie, J.S., Givan, S.A., and Carrington, J.C.
(2007) Genome-wide profiling and analysis of Arabidopsis siRNAs. PLoS Biol 5(3): e57.
siRNA - podsumowanie
Szlak siRNA wycisza obce DNA, transpozony i sekwencje powtarzalne.
U roślin, siRNA są wytwarzane przez białka podobne do Dicer
rozcinające dsRNA na 24 nt siRNA.
siRNA asocjuja z białkami AGO, z którymi tworzą kompleksy
wyciszające.
Kompleksy wyciszające mogą działać potranskrypcyjnie na docelowe
RNA, przecinając je lub zakłócając ich translację.
Kompleksy wyciszające mogą również działać na chromatynę,
wyciszając docelowe DNA przez metylację lub modyfikacje
zasocjowanych z nim histonów.
microRNA - miRNA
• miRNA prawdopodobnie wyewoluowały z siRNA, oba te rodzaje
małych RNA są wytwarzane i obrabiane w podobny sposób.
• U roślin występuje niewielka liczba silnie konserwowanych miRNA
oraz duża liczba nie konserwowanych miRNA.
• miRNA są kodowane przez specyficzne geny MIR, ale same
działają na inne geny – sa czynnikami regulatorowymi działającymi
w trans.
• U roślin miRNA regulują przede wszystkim rozwój i odpowiedzi
fizjologiczne
microRNA - miRNA
microRNA przecinają mRNA
lub zakłócają ich translację
Gen MIR
RNA Pol II
AGO
Zakłócanie
translacji
Przecina
nie
mRNA
AAAn
AGO
AGO
AAAn
AAAn
mRNA
RNA Pol II
miRNA i siRNA podlegają obróbce przez
pokrewne, ale odmienne białka DCL
AtDCL1 wytwarza miRNA
AtDCL2 - 4 wytwarza siRNA
W roślinach występuje 4 lub więcej białek DCL ,
więcej niż w jakichkolwiek innych organizmach.
Zwiększona różnorodność i liczba białek DCL
ma prawdopodobnie związek z rozbudowanym
systemem ochrony przed patogenami .
Reprinted from Margis, R., Fusaro, A.F., Smith, N.A., Curtin, S.J., Watson, J.M., Finnegan, E.J., and Waterhouse, P.M.
(2006) The evolution and diversification of Dicers in plants FEBS Lett. 580: 2442-2450 with permission from Elsevier.
miRNA i siRNA asocjują z kilkoma białkami
AGO
AGO1
AGO4
AGO1 preferencyjnie
przecina sekwencje
docelowe, asocjuje z
miRNA, ale także z
niektórymi siRNA
AGO4 preferencyjnie
asocjuje z siRNA i
pośredniczy w metylalcji
docelowego DNA.
W Arabidopsis
występuje 10 białek
AGO. Nie są zbyt
dobrze zcharakteryzowane. Ich funkcje
częściowo się
nakładają
Reprinted from Vaucheret, H. (2008) Plant ARGONAUTES. Trends Plant Sci. 13: 350-358 with permission from Elsevier.
Geny MIR są transkrybowane jako długie RNA,
które są przekształcane w miRNA
MIR gene
•miRNA sa kodoane przez geny MIR
•Pierwotny transkrypt miRNA (primiRNA) składa się w strukturę
dwuniciową, która podlega obróbce
przez DCL1
• Łańcuch miRNA* jest degradowany
pri-miRNA
5'
3'
5'
3'
miRNA
Cel miRNA
miRNA
miRNA*
Cele niektórych konserwowanych miRNA
Rodzina genowa
miRNA
Cel (rodzina genów)
Funkcja
156
Czynniki transkrypcyjne
SPL
Czas rozwoju
160
Czynniki transkrypcyjne
ARF
Odpowiedź na auksynę,
rozwój
165
Czynniki transkrypcyjne HDZIPIII
Rozwój, polarność
172
Czynniki transkrypcyjne
AP2
Czas rozwoju, tożsamość
organów kwiatowych
390
TAS3 (tasiRNA), działa na
czynniki transkrypcyjne ARF
Odpowiedź na auksynę,
rozwój
395
Transporter siarczanów
Pobieranie siarczanów
399
Ubikwitynacja białek
Pobieranie fosforanu
Adapted from Willmann, M.R., and Poethig, R.S. (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs in
plant development. Curr. Opin. Plant Biol. 10: 503–511..
miRNA u roślin wykazują odległe
podobieństwa do swoich celów
Duplikakcja genu
Uważa się, że miRNA
u roślin powstały ze
swoich sekwencji
docelowych w wyniku
duplikacji genów,
odwróconej duplikacji
i dywergencji.
Tylko niektóre miRNA
zapewniają przewagę
selekcyjną i są
zachowywane i
duplikowane.
Reprinted from Willmann, M.R., and Poethig, R.S. (2007) Conservation and evolution of miRNA regulatory programs
in plant development. Curr. Opin. Plant Biol. 10: 503–511 with permission from Elsevier.
tasiRNAs
tasiRNAs – trans-acting siRNAS
Kodowane przez geny TAS
Obróbka pierwotnego transkryptu inicjowana przez miRNA
TAS gene
RNA Pol II
tasiRNA są kodowane przez geny TAS
transkrybowane przez RNA Pol II
Transkrypt jest celem dla miRNA i
zostaje rozcięty
AGO
RDR6
Rozcięty transkrypt jest kopiowany do
dsRNA przez RNA zależną RNA
polimerazę (RDR6)
(dalszy ciąg na następnym
przezroczu)
Biogeneza tasiRNA
dsRNA jest rozcinany przez DCL4
na serię krótszych dsRNA,
uwalniając z jednego genu TAS
wiele cząsteczek tasiRNA.
Arabidopsis zawiera cztery
rodziny genów TAS
•Celami dla TAS1 i TAS2 tasiRNA sa
geny kodujące białka z
powtórzeniami pentapeptydowymi.
•Celem dla TAS3 tasiRNA są
czynniki transkrypcyjne ARF (auxin
response factors).
•Celem dla TAS4 tasiRNA sa
czynniki transkrypcyjne MYB.
Z każdego genu TAS powstaje szereg ‘przesuniętych w fazie’
tasiRNA
Miejsce wycięcia
miRNA w
pierwotnym
transkrypcie
tasiRNA mogą być
wytwarzane z
dowolnej nici
DCL4 porusza
się wzdłuż RNA
mierząc i
rozcianając go.
Reprinted from Allen, E., Xie, Z., Gustafson, A M., and Carrington, J.C. (2005) microRNA-directed phasing
during trans-acting siRNA biogenesis in plants. Cell 121: 207-221, with permission from Elsevier.
Mutacje wpływające na tasiRNA wpływają na przejście
fazowe
Mutacja rdr6-15
eliminuje wytwarzanie
tasiRNA
zip-1 eliminuje
wytwarzanie TAS3
tasiRNA
Obie mutacje oraz
mutacje dcl4 i tas3,
przyspieszają
zmianę fazową
Reprinted from Fahlgren, N., Montgomery, T.A., Howell, M.D., Allen, E., Dvorak, S.K., Alexander, A.L., and Carrington, J.C. (2006) Regulation of AUXIN RESPONSE
FACTOR3 by TAS3 ta-siRNA affects developmental timing and patterning in Arabidopsis. Curr. Biol. 16: 939–944 with permission from Elsevier.
nat-siRNAs
Nat-siRNAs – Natural cis-acting siRNAs
Wytwarzane z zachodzących na siebie
transkryptów. Udział w adaptacji do
stresów abiotycznych i biotycznych
Zachodzące geny
ds. RNA z
komplementarnych
transkryptów
AGO
Wyciszeni
e
AGO
Redrawn from Katiyar-Agarwal, S., Morgan, R., Dahlbeck, D., Borsani, O., Villegas Jr. A., Zhu, J.-K., Staskawicz, B.J., and Jin, H. (2006) A pathogen-inducible
endogenous siRNA in plant immunity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 18002–18007.
Zastosowania technologii małych
RNA
DNA tworzące siRNA
lub miRNA mogą być
stabilnie wprowadzane
do genomów roślin w
celu selektywnego
wyciszenia genów.
Wyciszanie genów
służy do eliminacji
alergenów z
orzeszków
ziemnych.
Kontrola szkodników
Kontrola
zainfekowana przez
pasożytniczegio
nicienia
Oporność
indukowana RNAi
Wyciszanie genów służy
do usuwania
Rośliny wyrażające dsRNA
szkodliwych związków z
odpowiadające wybranym genom
nasion bawełny, co
nicienia sa odporne na infekcje.
Wchlonietę przez nicienia dsRNA
pozwala na ich
indukuje wyciszenie jego genów.
zastosowanie jako
pokarmu.Huang, G., Allen, R., Davis, E.L., Baum, T.J., and Hussey, R.S. (2006) Engineering broad root-knot resistance in transgenic plants by RNAi
silencing of a conserved and essential root-knot nematode parasitism gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 14302–14306.
Podsumowanie
Małe RNA biorą udział w regulacji aktywności i ochronie genomu;
specyficzność ich działania wyciszającego opiera się na parowaniu
zasad.
Celami dla siRNA sa bogate w sekwnecje powtarzalne rejony
heterochromatyny, transpozony, wirusy i inne patogeny.
Celami dla miRNAs i tasiRNAs sa genby regulatorowe wpływające za
czasowy i przestrzenny wzór rozwoju, homeostazę pokarmową i
odpowiedzi na czynniki stresowe.