Transcript Interferencja RNA (RNAi, RNA interference)

Interferencja RNA (RNAi,
RNA interference)
Nobel 2006
Andrew Fire i Craig C. Mello
RNAi historia
 1998 – wprowadzenie dsRNA do nicienia C. elegans wycisza ekspresję genu o
sekwencji komplementarnej → interferencja RNA (Craig, Mello)
 pierwsze wskazówki jednak już w latach 1990: próba wprowadzenia
dodatkowego genu syntazy chalonowej daje efekt odwrotny – poziom mRNA
dla syntazy spada
Konserwatywny mechanizm w świecie zwierząt i roślin spełniający funkcje:
1. Obrona przed infekcjami wirusowymi
2. Obrona przed transpozonami
3. Regulacja metylacji DNA w obrębie promotora
Matzke MA, Matzke AJM (2004) Planting the Seeds of a New Paradigm. PLoS Biol 2(5): e133
Wprowadzenie do tytoniu dwóch osobnych transgenów
wykorzystujących taki sam promotor
CH3
promotor
promotor
Gen 1
x
Gen 2
Pierwszy transgen jest
aktywny o ile nie jest w
komórce obecny drugi
transgen → metylacja DNA
promotora wyciszanego
transgenu w obecności
drugiego zawierającego
sekw. homologiczne
 Wyciszenie i metylacja zanikają w kolejnych komórkach potomnych
na skutek odseparowania dwóch transgenów
 Interakcja wspólnych promotorów indukuje transkrypcyjne
wyciszanie ekspresji genów -TGS (transcriptional gene silencing)
siRNA (ang. short interfering RNA) – krótka dwuniciowa cząsteczka
RNA (21-23 nt) o sekwencji homologicznej do fragmentu docelowego
mRNA
DICER
końce 3’ mają 2nt
niesparowane
Uwaga: wprowadzanie
dsRNA do komórek
kręgowców indukuje
odpowiedź interferonową
DICER – enzym typu RNAza III
Zawiera domeny:
 Domena o właściwościach helikazy i hydrolazy fosfodwuestrowej;
 RBD (RNA Binding domain) – wiążąca RNA
 dsRBD (dsRNA Binding domain) – wiążąca dsRNA
 PAZ (Piwi, Argonaute, Zwille/Pinhead);
działa w postaci dimerycznej
→ produkty działania enzymu DICER mają niesparowane 2 nukleotydy na
końcu 3’ i grupę fosforanową na końcu 5’ (inne produkty słabiej indukują
interferencję)
RISC (RNA-induced silencing complex) jest
złożony:
1. Białka z rodziny Argonaute posiadają 3
domeny:
 PAZ – wiązanie końca 3’ siRNA
 Mid - wiązanie końca 5’ siRNA
 PIWI – aktywność endonukleazy
(pokrewna RNAzy H)
Ago1 – odpowiedzialny za represję, Ago2 –
za właściwości endonukleazy
do kompleksu RISC wchodzą jeszcze inne
białka o nieznanej dotąd funkcji (VIG, TudorSN, Fragile-X, Dmp68, Gemin3)
RISC jest częścią struktury
cytoplazmatycznej zwanej ciałkami P (Pbodies)
Degradacja mRNA przez kompleks RISC:
1. w kompleksie RISC dochodzi do degradacji nici sensownej, pozostaje
antysensowna (wiodąca); wybór nici jest uzależniony od stabilności
termodynamicznej końców siRNA – nić posiadająca mniejszą stabilność na
końcu 5’ pozostaje w RISC (etap katalizowany przez DICER)
2. w rejonie „seed” zlokalizowanym pomiędzy 2 i 8 nukleotydem od końca 5’
następuje rozpoznanie i wiązanie z docelowym mRNA
3. antysensowna nić hybrydyzuje z komplementarnym mRNA tworząc krótki
fragment dwuniciowy
4. przecięcie mRNA w pojedynczym miejscu oddalonym pomiędzy 11-12nt od
końca 3’ siRNA (Ago2)
5. dalsza degradacja mRNA przez niespecyficzne egzonukleazy
mRNA
siRNA
 w przypadku niepełnej komplementarności sekwencji siRNA do
mRNA zachodzi inhibicja translacji
Mechanizmy odpowiedzialne za ogólną degradację mRNA:
1.przed degradacją zachodzi proces deadenylacji końca 3’ poli(A), po
której następuje działanie egzonukleolityczne 3’ – 5’ przez egzosom
2.dekapowanie przez Dcp1/Dcp2, po którym degradacja przy udziale
egzonukleaz 5’ - 3’
Zjawisko przechodzącego wyciszania (transitive silencing)
GFP siRNA
białko fuzyjne UNC-22 i GFP
przejście wyciszenia w kierunku od 3’ do 5’
wyciszenie UNC-22 i GFP
wyciszenie GFP
Gregory J. Hannon RNA interference, Nature (2002) 418, 244-251
Mechanizm przechodzącego wyciszania
pierwotne siRNA
polimeraza RNA
zależna od RNA RdRP
(RNA-dependent RNA
polymerase)
dsRNA
wtórne siRNA
Brodersen and Voinnet The diversity of RNA silencing
pathways in plants TRENDS in Genetics (2006) 22, 268-280
Metody wytwarzania siRNA:
1. synteza chemiczna (siRNA)
2. transkrypcja in vitro (esiRNA)
3. wektory ekspresyjne siRNA (shRNA jako pośredni etap)
4. ekspresyjne kasety PCR
Kryteria projektowania cząsteczek siRNA:
1. Znajdź sekwencję 21nt która zaczyna się od AA (siRNA posiadające
jednoniciowe odcinki UU działają najefektywniej); jeśli się nie da – należy
wybrać sekwencję NA lub inną ale unikać jednoniciowych odcinków GG w
siRNA
2. Zaprojektuj 2-4 sekwencje w różnych rejonach ale 50-100nt poniżej AUG (w
obrębie 5’ UTR lub 3’ UTR mRNA może być związane z białkami oraz posiadać
złożoną strukturę) – jedna na dwie daje 50% hamowanie a jedna na cztery –
75-95%
3. zawartość GC – 30-70% (optymalnie 50%)
4. unikać ciągu (G)3 gdyż mogą się tworzyć agregaty cząsteczek siRNA
5. koniec 5’ nici antysensownej ma mieć mniejszą stabliność termodynamiczną
6. Sprawdź komplementarność do innych genów