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生物中心主要项目 吕成伟 南方医院生物治疗中心 应用项目 CIK (Cytokine induced killer) TIL (Tumor infiltrating lymphocytes) DC/CTL (Dendritic cell / Cytotoxic T lymphcytes) 放免靶向治疗（131I -McAb ） 肿瘤标志物 CIK IL-2 1976年Morgan等发现小鼠脾细胞培养上 清能刺激胸腺细胞生长的T细胞生长因子； 1979年统一命名为IL-2。 1980年发现IL-2 能诱导自身LAK。 1983年Taniguchi等从Jurkat白血病细胞 成功克隆人IL-2的cDNA，基因工程IL-2问 世，推动了基础和临床应用。 肿瘤、免疫缺陷、感染等 CIK IL-2 IL-2主要由T细胞或T细胞系产生： （1）CD4或CD8 T细胞： 丝裂原 CD4或CD8 同种异体Ag CD4 (PBMC、脾脏、淋巴结和扁桃腺T细胞） （2）T细胞肿瘤细胞系或白血病细胞系 （3）T淋巴细胞杂交瘤 CIK IL-2生物学作用： （1）CD4及CD8细胞都是IL-2作用靶细胞 （2）促进杀伤细胞分化和效应功能： 诱导CTL、NK、LAK等分化和效应功能 诱导杀伤细胞产生IFN-γ、TNF-α等 增强CTL穿孔素基因表达 （3）直接或间接作用B细胞 （4）活化巨噬细胞： 促进Mφ 通过ADCC杀伤肿瘤 CIK LAK细胞 1980年NIH癌症研究所Rosenberg等首先发现 LAK细胞(lymphokine activated killer cell): 1. 纤维肉瘤C57BL/6小鼠脾细胞＋ IL-2 2. 纤维肉瘤细胞（自身正常细胞－） PBL + IL-2 自体或同种异体瘤细胞(MHC 非限制性） 3. LAK存在于大颗粒淋巴细胞（large granular lymphocytes,LGL)中，不同于T、B细胞和单核细胞 CIK 多种细胞因子均可增强LAK活性： GM-CSF、TNF、IL-1、3、5、6 IFN-γ显著增强LAK活性 Anti-CD3 McAb联合IL-2不仅能比单 用IL-2更显著增加LAK数量也使单个和总体 LAK细胞活性显著增加。（100～400倍 /6~20倍） CIK LAK体外长期培养:(临床) 3～5天 2～3周 数量100～1000倍 联合PHA或ConA 数量比单用IL-2高5～10 倍。初始培养48小时内加入10ng/ml Anti-CD3 扩增更明显，21天达1000倍。加入IFN-γ单个 LAK细胞抗瘤活性提高几十倍。 LAK CIK (Cytokine induced killer) CIK CIK的杀瘤机制 直接杀瘤： 识别结合相 杀伤相 裂解相 效靶复合体 细胞毒颗粒；穿孔素；Ca++ 间接杀瘤： IL-2、TNF-α、IFN-γ、IL-1α等的细胞毒/抑制 作用；相互诱生、协同增强NK、Mφ杀伤肿瘤细胞。 CIK 应用 只有联合应用IL-2/LAK细胞才具有显著的体内 抗肿瘤作用。 1984年11月，FDA批准NCI进行临床试验。 1985年Rosenberg等首次报道联合IL-2/LAK 细胞治疗25例各种常规疗法治疗无效的晚期肿 瘤患者的临床疗效。 IL-2/LAK细胞引起世人瞩目，并在基础和临床 得到推广和改进。 肾细胞癌、黑色素瘤、结直肠癌、非何杰金氏 淋巴瘤等疗效显著。 CIK CIK制备流程 TIL 简介 1986年发现经IL-2诱导的TIL体内抗瘤效果强于 LAK 50～100倍；并可减少IL-2用量及副作用。 肿瘤间质，T淋巴细胞，CD8为主，非活化，拌 用少量IL-2即可发挥明显抗瘤效果，副作用轻。 新TIL中T细胞对PHA呈低增殖反应，少分泌IL-2、 IFN-γ等。 Anti-CD3 McAb联合IL-2不仅能比单用IL-2更显 著增加TIL数量也使单个和总体TIL细胞活性显著 增加。可减少IL-2用量。 TIL TIL体外抗瘤作用 1. 经IL-2激活后TIL才具有显著杀伤活性（7～ 40天）。 2. TIL杀伤活性具有一定特异性。 3. IL-4、TNF、IFN-γ等可显著增强TIL杀伤作 用。 4. 肿瘤抗原可增强TIL杀伤活性。（照射肿瘤 细胞） TIL TIL的体内抗肿瘤作用 1. TIL/IL-2输注具有显著的体内抗肿瘤转 移效果。 2. TIL体内抗肿瘤转移作用有一定特异性。 3. IFN-α可增强TIL/IL-2体内抗肿瘤转移 作用。 4. 环磷酰胺增强TIL体内抗肿瘤作用。 CIK/TIL CIK/TIL制备流程 无菌条件下抽取外周血/胸腹水（以肝素抗凝） 密度梯度离心 1500-2000rpm，15-20分钟 分离获取外周血单个核细胞（PBMNC) 600-800rpm，5分钟 纯化PBMNC(去除Ficoll、血小板及杂质） 计数，1×10e6个细胞/ml置培养瓶37℃， 5%CO2，100％湿度 诱导活化(IL-2,Human-serum,Anti-CD3,r-IFN,PHA) 第5－7天 高效扩增（IL-2,Human-serum,Anti-CD3) 第10-14天 收集CIK/TIL，全身/局部回输 CIK/TIL *CIK/TIL临床应用 CIK每疗程不低于100亿细胞；首次抽 血前一周或抽血后即可输注IL-2；首次 抽血后7～9天第一次回输CIK细胞。每 周抽血一次，回输细胞两次；5～6周一 疗程，全程拌IL-2治疗。 TIL细胞经胸腔或腹腔穿刺收集胸腹水 200ml以上，分离淋巴细胞培养，7～ 21天内分1～3次胸腹腔输注完毕。同时 配合IL-2 20-50wu局部应用，2-3/周至积 液完全吸收(或疗程结束)。 DC/CTL DC细胞 1973年Steinman和Cohn等从小鼠脾组织 分离 共同特征：树突状，膜MHC-Ⅱ、CD80、CD86，活 化初始T细胞，激活CD8CTL、CD4Th细胞；非成熟DC 摄取、加工、处理抗原，成熟DC递呈抗原能力是B、Mφ 的100~1000倍，体内唯一专职抗原提呈细胞；MHC限 制性。 来源：骨髓、外周血、脐带血。 肿瘤的发生与DC的功能缺陷 通过对肿瘤浸润性ＤＣ的研究发现： 肿瘤细胞能自发分泌免疫抑制性细胞因子 ＶＥＧＦ、ＴＧＦ-β、ＩＬ-10等作用于Ｄ Ｃ，使其表面分子的表达发生变化，无法 提呈外来抗原或提呈抗原的能力低下，导 致了肿瘤的免疫逃逸。 DC治疗的理论依据 将机体的ＤＣ提取出来，经体外各种免疫 调节剂的激活，再用各种形式抗原修饰Ｄ Ｃ(肿瘤抗原肽、细胞性抗原、ＤＮＡ或Ｒ ＮＡ等)，然后回输体内，激活Ｔ细胞 ,产 生强大的抗肿瘤免疫反应，从而解决因Ｄ Ｃ功能缺陷造成的肿瘤免疫逃逸。 DC/CTL制备 DC/CTL/IL-2的实施 (1) 微量法：抽血200ml/次，2周一次，共4 次为一疗程，全程用IL-2 50-200wu 30-40次，或/和加IFN-γ 100wu 2030次。 (2) 机分法：分离5000ml外周血收集单个核 细胞。 放射免疫治疗的定义 以单克隆抗体为载体，以放射性核素为弹 头，通过抗体特异性结合抗原表达阳性的肿瘤 细胞，将产生β或α射线的放射性核素靶向到肿 瘤细胞，并与肿瘤细胞特异性结合，实现对肿 瘤的近距离内照射治疗。 单克隆抗体靶向治疗两种作用方式： 1.直接作用：通过抗体依赖性细胞介导细胞毒 （ADCC）、补体依赖细胞毒（CDC）的细胞溶解 效应杀伤肿瘤细胞。 2.间接作用：单抗作为靶向载体，偶联细胞毒药 物（放射性核素、化疗药物、毒素等）。靶向肿瘤 后利用细胞毒杀伤肿瘤细胞。 放射免疫治疗是利用放射性 核素的辐射对肿瘤细胞进行杀伤 作用。它必须是发射能量较大的 β射线、α粒子，最好是不发射γ 射线对病房的防护较方便。符合 上述条件的放射性核素不多。 90Y、186Re、188Reβ辐射能量 大是放射免疫治疗的首选放射性核素， 但国内来源较困难，标记技术也较复杂。 131I为β能量较小，也存在γ辐射给辐 射防护带来不便，但其供应十分方便， 因此，是国内放手免疫治疗最常用的核 素 2003年Press OW在Seminars in Oncology: 当前低度NHL治疗最有希望的治疗药物 之一是能识别肿瘤相关抗原的单克隆抗 体，…..如今，最有希望的免疫连接物 是放射性标记的抗体。 IODO-GEN碘化标记 IODO-GEN是固相氧化剂，其碘化标记 法于1978年由Fraker首先报道放射性碘 溶液和蛋白质同时放入已用IODO-GEN 包被的容器中，－I被氧化并立即取代蛋 白质上酪氨酸残基中的H而成为放射性碘 化标记蛋白。经过数分钟后将标记物从容 器中吸出即终止反应。经凝胶柱过滤后即 可得到碘化标记物纯品。 放射免疫治疗淋巴瘤的优势 恶性淋巴瘤具有良好的放射敏感性 治疗效果不受机体免疫功能影响 β射线 穿透力强，可到达肿瘤深部 疗效可靠，毒副作用少 病例选择条件 所有患者均有预后不良因素：如晚期、高危、初 治未达缓解、复发及全身多处淋巴结肿大； 无重要脏器功能不全； Karnofsky评分≥60分； 年龄≤70岁； 外周血常规白细胞（WBC）≥3.0×109/L，血小 板（PLT）≥80×109/L，血红蛋白（HGB） ≥90g/L； 病理免疫组化提示CD20(++~+++)。 治疗模式 治疗模式 非清髓剂量 清髓剂量 CD20单抗 100-200mg 200-400mg 131I 50-100mci 150-300mci 131I-抗CD20抗体应用方案 标记方法：固相氧化剂标记法（IODOGEN）。 甲状腺保护：用药前一周至用药后一周连续口服1%碘化 钾溶液10~20ml/次，每日三次。 标记率及用法：每次剂量抗CD20抗体 100mg标131I 50~100 mCi，1/3局部病灶直接注射，2/3静脉全身使 用。每2~3个月一次，2~3次为一疗程。 预防过敏反应：用药前30~60分钟苯海拉明40mg肌注。 131I-抗CD20抗体的毒副反应和处理 畏寒发热 普威、非那根 局部红肿 不处理或普威、消炎痛 重度骨髓抑制 (WBC≤1.0×109/L， PLT≤25×109/L，HGB≤65g/L) 住无菌层流 病房，皮下注射G-CSF，补充血小板、红细胞， 预防感染，防止出血 放射免疫治疗其它肿瘤 食管癌、胃癌、结直肠癌、卵巢 癌肝癌、前列腺癌、乳腺癌等