Transcript Octet RED System原理

藕合型生物毒素BtA的合
成及杀虫机理研究
报告人：潘志针
福建省农业科学院农业生物资源研究所
二O一二年五月二十三日
研究意义
基因突变
新型Bt毒素筛选
蛋白质工程
研究内容
• BtA生物藕合体系的构建
- Bt毒素蛋白的纯化
- 阿维菌素的结构修饰
- 藕合试剂的选择与藕合条件的优化
• BtA杀虫作用机理的研究
- Octet RED System技术的介绍
- BtA与BBMV相互作用的研究
- Bt和BtA杀虫毒力的比较
BtA藕合体系
BtA藕合体系的构建
Bt毒素蛋白
的纯化
阿维菌素结
构修饰
新型藕联剂
NHS+EDC
BtA藕合效
率的检测
Bt毒素蛋白的纯化
Bt晶体的提取
苏云金芽孢杆菌晶体
Bt菌株：HD-1
方法：等电点沉淀法
发酵培养：挑取活化的HD-1接种于LB液体
培养基中，30 ℃ 200r/min摇瓶发酵培养3
天。
碱裂解：待芽孢产生时，将发酵液于4℃、
10,000 g离心10 min，取沉淀。沉淀重悬
于50 mmol/L Na2CO3（pH 10，含50
mmol/L的EDTA，3%巯基乙醇）缓冲液中，
4 ℃静置2 h
等电点沉淀法提取Bt晶体：取菌悬液于
10,000 g 离心30 min，取上清用4 mol/L
NaAc–Hac（pH值4.0）调节pH值至5. 0左
右。4℃静置过夜， 10000r/min 离心30
min，灭菌去离子水洗涤3次，沉淀冷冻干
燥后-20℃保存。
Bt毒素蛋白的纯化
冷冻干燥后的Bt晶体
1-Bt原毒素
2-BtA毒素
3-胰蛋白酶降解的Bt毒素
4-胰蛋白酶降解的BtA毒素
阿维菌素羧基化改造
4’’
C-7
双糖结构
“勺柄”
5
大环
内酯
结构
阿维菌素的改造路线
C5-OH的保护
氮气保护下的反应装置图
4’’-O-琥珀酰-AVM的合成
对甲磺酸苯磺酸
乙酸乙酯和水萃取
C5-OH的脱保护处理
TLC
硅胶柱层析
质谱和核磁鉴定
生物藕合试剂
三功能
交联剂
零长度交联剂
异型双功能
交联剂
同型双功能
交联剂
两端带有相同的
功能基
两端带有不同的功能基
胺反应性的交
联剂
胺和巯基反应性
的交联剂
生物藕合试剂的选择
EDC/NHS藕合
《生物藕合技术的原理与应用》P94
BtA藕合效率的检测
 荧光滴定法测定BtA藕合效率
蛋白质由于含有酪氨酸色氨酸等基团，会使蛋白质发出荧光。随着
阿维菌素与Bt晶体的藕合会使Bt晶体的构象或引起内源荧光发射的氨
基酸残基的微环境发生变化，从而导致其荧光光谱的最大发射峰等的
变化由此我们可以建立Bt晶体与阿维菌素结合的荧光滴定模型。
荧光滴定模型
Kd’为小分子与蛋白质结合的本征结合常数，P表示游离的Bt蛋白的浓度，R
表示游离的4"-O-琥珀酰阿维菌素的浓度，PR表示藕合的BtA的浓度。n表示BtA中结
合的4"-O-琥珀酰阿维菌素的分子数。设a为Bt蛋白上与4"-O-琥珀酰阿维菌素结合的
位点的百分数，Po表示总的Bt蛋白的浓度，Ro表示总的4"-O-琥珀酰阿维菌素的浓度，
那么R=Ro-PR=Ro-nPo（1-a），则得到：
荧光滴定模型
此外，由滴定曲线我们又可以得到：
F表示在适当的Ro时的荧光强度。Fmax表示滴定饱和时的
荧光强度。Fo则表示滴定前的荧光强度，进而测定本征结合常
数和藕合位点数。
荧光滴定体系
配制 5 μM的Bt蛋白母液，3 mM和
7.5 mM的阿维菌素及4"-O-琥珀酰
阿维菌素的母液。
25℃，激发波长为280 nm，激发
狭缝和发射狭缝宽均为5 nm，扫描
范围285~430 nm，扫描速度600
nm/min，每个1 nm收集一次数据，
荧光发射光谱均扫描3次取平均值。
固定荧光分光光度计的光路，加入
1ml的Bt蛋白母液，按Bt蛋白摩尔浓
度倍数0.6、1.2、1.8、2.4、3、4.5、
6、7.5、9、10.5的倍数，逐次加入
阿维菌素及4"-O-琥珀酰阿维菌素，
每次1μl 。
荧光滴定结果
阿维菌素滴定Bt蛋白
M
DMF（溶剂对照）
阿维菌素
改造并活化后的阿维菌素
4“-O-琥珀酰AVM滴定Bt蛋白
荧光定量滴定法测定BtA藕合效率
n=5
Kd=6.44 μmol/L
1-Bt原毒素
2-BtA毒素
3-胰蛋白酶降解的Bt毒素
4-胰蛋白酶降解的BtA毒素
荧光滴定法测定BSA-A藕合效率
4-O-琥珀酰AVM滴定BSA蛋白的荧光图谱 NHS/EDC活化后4-O-琥珀酰AVM滴定BSA蛋白
1-BSA
2-BSA
3-BSA-A
4-BSA-A
n=5.3
Kd=25.7 μmol/L
研究内容
一、BtA生物藕合体系的构建
二、BtA杀虫的机理的研究
Gill et al.（2002）研究发现Bt毒素蛋白的杀
虫毒力主要与靶标害虫BBMV上受体的相互作用有
关。因此BtA杀虫机理的研究将围绕着BtA与BBMV
上受体的相互作用情况展开。
Bt毒素杀虫机制
Bravo A et al. 2000
Octet RED System 组成
Octet仪器中内部主要结构
Octet RED System原理： 生物膜干涉技术

当一束可见光从光谱仪射出后，在传感器末端的光学膜层的两个界
面会形成两束反射光谱，并形成一束干涉光谱。

任何由于分子结合而形成的膜层厚度变化，能够通过干涉光谱的位
移值而体现。
干涉光谱位移-时间曲线图可以提供动力学参数
Relative Intensity
100%
0
Wavelength (nm)
ƒ( )
Intensity λ =
nm shift
Distance
between the
two reflecting
surfaces = ℓ
λ, ℓ
Function of density and optical thickness
Time
靶标蛋白的固化
生物素-链霉亲和素（SA 传感器）:
NH2
(in solution)
Streptavidin
biosensor
NH2
Minimal
biotinylation
Immobilization
Biotin
Biotin–linker-NHS
H2N
H2N
Biotin
Streptavidin
biosensor
NH2
NH2
1. 生物素的标记以及标记的蛋白的固化不受环境影响，蛋白由于标记而失活的概
率很低。
2. 在中性的pH与温和的环境中反应，生物素与蛋白的摩尔比最好比较低（理想的
是1:1）
3. 生物素标记后需要用脱盐柱除去剩余的生物素试剂，生物素链霉亲和素非常稳定，
可重复 性好，而且易于保存。
传感器的固化
直接偶联（最普遍的是胺基偶联，AR传感器）
Amine Reactive
biosensor
Activation
Amine Reactive
biosensor
Immobilization
Amine Reactive
biosensor
NH2
EDC/NHS
H2N
NH2
NH2
蛋白质的固化在酸性的pH 中进行(commonly pH 5); 一般需要对pH
进行优化。
2. 容易导致蛋白失活
3. 很多偶联试剂需要新鲜配制，而且需要加入封闭步骤（乙醇胺）
1.
与本项目生物藕合的原理一致
Octet平台动力学检测自动化流程
Octet Biosensors
Buffer
Ligand-Biotin
Protein of Interest
Binding (nm)
Baseline
Baseline
Loading
Association
Dissociation
Time
•
•
•
•
一次检测8个通道
所有数据是实时的
反应的时间，位置，转速，温度，步骤可以自行设定
Baseline, Association和Dissociation三步对于计算动力学
参数KD值是必须得。
动力学参数的计算
1:1 binding模型:
Ab + Ag
ka
Complex
kd
Non-linear curve
fit of data 
Y=Y0+Req(1-e-kobs*t)
Kobs=Ka*[S]+Kd
ka = 结合常数，Kon
kd = 解离常数，Koff
Y=Y0+Ae-kd*t
KD =
kd
ka
动力学参数的特性

表观结合常数，kobs
• Kobs与浓度呈线性关系，斜率为Ka,截距为Kd.(kobs = ka[S] + kd).

结合常数, ka
• 复合物（AB）的形成速率，在1M的A或B下，每秒产生的复合物数量
• 单位为 M-1s-1, 一般从 103 到107 M-1s-1

解离常数, kd
•
•
•
•

反应了复合物的稳定性, 每秒中解离的复合物的百分比
kd= 0.01 s-1= 每秒钟有1%的复合物解离
Kd越大，解离越快
单位为s-1, 一般在 10-2 至10-5 s-1.
亲和常数, KD
• kd/ka的比值. 是平衡常数的倒数。当浓度为KD时，平衡信号Req为Rmax的一半
• Req= Rmax*[S]/(KD+[S])，求得KD
• 表示了相互作用亲和能力的大小。
Bt、BtA与BBMVs的相互作用的研究
生物素标记Bt、
BtA蛋白
靶标害虫中肠
的提取
脱盐柱去除未
标记的生物素
BBMVs蛋白
的分离纯化
标记Bt、BtA
固定于探针
Octet RED System
研究Bt、BtA与靶标
害虫中肠BBMVs上受
体的相互作用
Bt毒素与BBMVs的相互作用的研究
BtA毒素与BBMVs的相互作用的研究
Bt、BtA与BBMV相互作用的研究
Bt与BBMV的解离常数（KD)和解离速率（kids）
BtA的KD值仅
为Bt的29%
BtA的kids值仅
为Bt的44%
BtA与BBMV的解离常数（KD)和解离速率（kids）
Bt和BtA杀虫效果的比较
 以小菜蛾为供试虫研究Bt与BtA的杀虫毒力
回归线方程
置信区间
LD50(μg/ml) 毒力倍数
Bt
Y=6.2334+2.94
99X
0.2905--0.5019
0.3818
1
BtA
Y=15.6362+9.1
049X
0.0019--2.4381
0.0679
5.6
技术展望
BtA藕合效率的鉴定
SDS-PAGE
法
高效液相色
谱法
荧光光
谱法
Octet RED
System
BtA对靶标害虫抗药性延缓的机理
BtA在靶标
害虫中肠的
定位
BtA与靶
标害虫中
肠受体的
结合
RT-PCR研
究BtA对
受体表达
影响
蛋白质组
研究BtA
对受体表
达作用