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Oxidation-induced intramolecular disulfide
bond inactivates mitogen-activated protein
kinase kinase 6 by inhibiting ATP binding
Yarui Diaoa, Wei Liua, Catherine C. L. Wongb, Xi Wanga, Kaman Leea, Po-yan Cheunga,
Lifeng Pana, Tao Xub, Jiahuai Hanc, John R. Yates IIIb, Mingjie Zhanga, and Zhenguo Wua,1
Reporter: Gao Wei
Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Dec 7;107(49):20974-9.
邬振国
香港科技大学生命科学部教授
深圳北京大学香港科技大学医学中心教授
1，阐述了LMP1激活JNK及NF-KappaB信号通路的分子机理。
2，首次发现不同的JAK/STAT信号通路可以调控骨骼肌细胞的分
化 及因损伤诱导的骨骼肌再生。
3，阐述了MKK6的蛋白激酶活性受氧化还原状态调控的分子机理。
1. Diao Y, Guo X, Li Y, et al. Pax3/7BP is a Pax7-and Pax3-binding protein that regulates the
proliferation of muscle precursor cells by an epigenetic mechanism[J]. Cell stem cell, 2012, 11(2):
231-241.
2. Xiao, Fang, et al. "Oncostatin M inhibits myoblast differentiation and regulates muscle
regeneration." Cell research 21.2 (2011): 350-364.
3. Diao, Yarui, et al. "Oxidation-induced intramolecular disulfide bond inactivates mitogen-activated
protein kinase kinase 6 by inhibiting ATP binding." Proceedings of the National Academy of
Sciences 107.49 (2010): 20974-20979.
4. Ma, Ning‐Fang, et al. "Isolation and characterization of a novel oncogene, amplified in liver
cancer 1, within a commonly amplified region at 1q21 in hepatocellular carcinoma." Hepatology
47.2 (2008): 503-510.
5. Sun, Luguo, et al. "JAK1–STAT1–STAT3, a key pathway promoting proliferation and preventing
premature differentiation of myoblasts." The Journal of cell biology 179.1 (2007): 129-138.
“TXY” motif
ERKs：extracellular signalregulated kinases
JNKs：cJun N-terminal kinases
整体思路：
现象
1.验证MKK6是Redox sensor
2.验证MKK6形成分子内二硫键
机制
3.鉴定MKK6形成二硫键的关键Cys位点
4.验证MKK6二硫键影响酶活的相关机制
意义
5.验证hMKKs的redox调控具有普遍性
最初的问题，来源于对p38/MAPK信号通路受ROS调控的探究兴趣
上游的直接调控蛋白MKK6是否就是一个Redox sensor？
作者团队前期有研究MKK6:
Cheung, Po-yan, et al. "p150Glued, Dynein, and microtubules are specifically required for activation of MKK3/6
and p38 MAPKs." Journal of Biological Chemistry 279.44 (2004): 45308-45311.
验证MKK6是一个Redox sensor
(Trx)-6xHis-MKK6和(GST)-p38α(K82M) (kinase-dead)
TNF-α (10ng/mL)：激活MAPK/p38 通路
PMA (1 μM): 佛波醇，促进内源性ROS
通过体内外实验，证实MKK6的活性受氧化还原调控，并且与二硫
键形成有关（DTT处理可以恢复活性）。
初步证实MKK6是一个受氧化还原调控的蛋白
接下来应该是思考如何进一步证实MKK6受氧化还原调控，并深入寻找调控机制。
寻找形成二硫键的Cysteine位点
验证氧化还原调控是通过作用于该位点来实现的
存在凝胶shift，同时非还原性胶，无多聚体（高
分子量条带）：提示极有可能是分子内二硫键，
如何进一步确认？
β-mercaptoethanol：β-巯基乙醇，还原剂
C109是激酶活性改变的关键位点
体外验证：在结构分析假设的基础上，利用Cys突变，进行位点验证
猜测C109和C196形成二硫键
4C：C38S、C216S、C128L、C128M
DTNB巯基检测反应原理：
进一步验证C109与C196形成二硫键
先用IAM（碘乙酰胺：烷化剂，
与巯基结合）与巯基反应结合。
质谱shift: 57.02 Da
还原处理后，再用NEM（N乙
基-马来酰亚胺：烷化剂，与巯
基结合）与新生成的自由巯基
反应。质谱shift: 125.04 Da
进一步验证C109与C196形成二硫键
直接将重组的MKK6蛋白
进行酶解后质谱检测。
氧化形式的MKK6质谱检测
到含有二硫键结构肽段
还原形式的MKK6质谱未检
测到含有二硫键结构肽段
体内验证：C109和C196形成二硫键
A，
H2O2处理后，4C型MKK6不
存在还原形式巯基。
说明未突变的C109和C196是
二硫键形成位点。
B，先用IAA（碘乙酸）不可
逆与还原巯基结合，再还原
处理后用B-IAM标记新生成
还原巯基（即原来形成二硫
键的巯基）。
C，利用PMA（佛波醇）
处理RAW264.7细胞，诱导
内源ROS，会减少还原形
式的Bio-labled MKK6。
体内外验证了C109和C196是MKK6形成二硫键的Cys位点。
解释了MKK6受氧化还原调控的机制。
如何进一步说明MKK6的活性受氧化还原调控，是基于C109和C196的二硫键调控？
最开始的现象：
进一步的机制：
MKK6的C109和C196能形成二硫键，
并受Redox调控。
MKK6激酶活性受Redox调控。
？
MKK6的C109和C96与MKK6激酶活性之间的关系是什么？
验证质粒转染效果
C109和C196未突变型MKK6，激
酶活性收到H2O2影响，而6C型
MKK6，酶活不受H2O2影响
说明C109和C196可以影响MKK6活性：
胞内氧化可以引起C109和C196形成二
硫键，并降低MKK6的激酶活性
Sorbitol:山梨醇，可激活MAPK/p38信号通路
之前实验已经证实C109和C196可以影响MKK6活性：
胞内氧化可以引起C109和C196形成二硫键，并降低MKK6的激酶活性
二硫键的形成，是通过什么机制影响MKK6的激酶活性？
1，改变MKK6的空间结构，使酶结构域不能发挥作用？
2，改变MKK6底物结合域，不能作用于底物？
3，其他可能？
A，验证MKK6氧化型和还原型二级结构：二级结构没有发生改变
B，底物p38结合实验证实：氧化和还原状态对MKK6的底物结合能力影响不明显
C，检测MKK6与ATP的结合能力：氧化形式MKK6与ATP结合能力降低。
说明二硫键是通过影响MKK6的ATP结合能力，从而影响MKK6激酶活性。
圆二色光谱(简称CD)是应用最为广泛的测定蛋白质二级结构的方法。
(BODIPY FL-AMPPNP：ATP类似物，作为荧光探针。
至此，已经证实：MKK6的C109和C196位点会在ROS
作用下，形成二硫键，从而阻断MKK6与ATP的结合，
导致MKK6失活，不再具备激酶活性。
这种调控是否具备普遍性？
其他MKK激酶是否也具备类似的调控？（位点、ATP结合能力）
“TXY” motif
ERKs：extracellular signalregulated kinases
JNKs：cJun N-terminal kinases
A，验证了C109和C196位点在hMKKs具备高度保守性
B，放射自显影：底物磷酸化检测，以JNKK和MKK1为例，验证了其他
hMKKs的激酶活性同样受Redox调控
总结：
验证了MKKs能够通过C109和C196位点的氧化，形成二硫键，从
而阻断与ATP的结合，导致失活，不再具备MAPKK激酶活性。
Thank you