Transcript PCR (POL*MERAZ Z*NC*R REAKS*YONU)

PCR
(POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU)
GÜLBEYAZ ÇEVİK
İLK KEZ
1985'de bilim dünyasına sunulduğundan
itibaren polimeraz zincir reaksiyonu (PCR); hem
araştırmada hem de klinik laboratuarlarda
tanıda yeni bir çığır açmıştır. ABD'de Henry A.
Erlich, Kary Mullis ve Randall K. Saiki
tarafından geliştirilmiştir.
PCR’IN TEMEL PRENSİPLERİ
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), in vitro
koşullarında DNA dizilerinin çoğaltılması
esasına dayanmaktadır.
 PCR;
basit
spesifik
hassas bir tekniktir.
PCR’IN TEMEL PRENSİPLERİ
PCR tekniği, temelde üç aşamadan oluşmaktadır.
1)DNA Zincirinin Açılması (Denaturation)
Kalıp DNA (template DNA), 92-95 oC’de 1-2 dakika
tutularak çift sarmal yapıdaki DNA iplikçikleri
birbirlerinden ayrılmaktadır. DNA zincirini ayırmak
için, bazı durumlarda 5-10 dakika ön ısıtma yapmak
gerekebilir.
PCR’IN TEMEL PRENSİPLERİ
2)Primerlerin Açılan DNA Zincirlerine Yapışması
(Annealing)
Reaksiyon sıcaklığının, 37-65 oC’ye düşürülerek
oligonükleotid primerlerinin açılan DNA zincirlerinin
kendi baz dizilerine karşılık gelen bölgeye yapışması
işlemidir.
Bu işlem, üretilecek baz uzunluğuna bağlı olarak 3060 saniyede gerçekleşmektedir.
PCR’IN TEMEL PRENSİPLERİ
3) Primer Uzaması (Primer Extesion)
DNA zincirleri üzerine yapışan primerlerin DNA
polimeraz enzimi (Taq DNA polymerase) vasıtasıyla
uzatılmasıdır.
Taq DNA polymerase 72 oC sıcaklıkta daha iyi
çalıştığı için genel olarak tüm çoğaltma işlemleri bu
sıcaklıkta yapılmaktadır.
POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU
• In vitro DNA (gene) amplifikasyon tekniği
5’
5’
5’
5’
5’
3’
3’
3’
3’
3’
DNA
3’
3’
3’
3’
3’
5’
5’
5’
5’
5’
>90°
POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU
5’
3’
37–65°
3’
5’
POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU
5’
3’
72°
3’
5’
POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU
5’
5’
5’
3’
3’
3’
>90°
37–65°
72°
3’
3’
3’
5’
5’
5’
POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU
5’
3’
>90°
37–65°
72°
3’
5’
POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU
>90°
40–60°
72°
POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU
2n x
PCR: 3 steps


Üç basamaktan (denaturation, annealing, primer
extension) oluşan işlem, bir PCR devrini temsil eder. Bu
işlem, genel olarak 25 ile 40 defa tekrar edilerek
başlangıçtaki DNA dizisinden milyonlarca yeni DNA
parçacığı çoğaltılır.
PCR sonucunda elde edilen DNA parçacıkları agaroz
veya poliakrilamit jellerde yürütüldükten sonra, ethidium
bromide (EtBr) veya gümüş nitrat (GN) ile boyanarak
gözlemlenir.
PCR OPTİMİZASYONU
PCR şartları yeni PCR uygulaması için uygun bir
şekilde yeniden ayarlanmazsa bazı problemlerle
karşılaşılabilmektedir. Bu problemler;





PCR’dan beklenen ürün ya az alınır yada hiç alınmaz.
Primerlerin yanlış bağlanmasından dolayı spesifik olmayan
bantlar oluşabilir.
Primerler yanlış şekilde uzayabilir.
Primer-dimer oluşumu ortaya çıkabilir ve bu oluşumlar
çoğaltma işlemini yavaşlatır.
Yeni sentezlenen DNA dizilerinde mutasyon veya
istenilenden farklı diziler ortaya çıkabilir.
PCR ÇALIŞMA ŞARTLARINI ETKİLEYEN
FAKTÖRLER
1)Enzim Konsantrasyonu
Diğer PCR şartları optimum seviyede olduğu
zaman 100 μl reaksiyon için önerilen Taq DNA
polimeraz enzim konsantrasyonu 1-2.5 ünitedir.
Fakat enzim gereksinimi kullanılan kalıp DNA veya
primere göre değişebilir.
Enzim konsantrasyonu düşük olursa elde
edilecek ürün (DNA) az olur. Enzim konsantrasyonu
yüksek olursa spesifik olmayan bantlar ortaya
çıkabilir
PCR ÇALIŞMA ŞARTLARINI ETKİLEYEN
FAKTÖRLER
2)Magnezyum Konsantrasyonu
Mg konsantrasyonu primerlerin açılan DNA
zincirlerine yapışmasını, kalıp DNA’nın açılma
sıcaklığını, PCR sonucunda elde edilen DNA
kalitesini, primer-dimer bağ oluşumlarını, enzim
aktivitesi ve güvenilirliğini etkilemektedir.
Taq DNA polimeraz enziminin iyi bir şekilde
çalışabilmesi için; kalıp DNA, primerler ve nükleotid
bazları üzerinde serbest Mg iyonlarının bulunması
gerekir.
PCR ÇALIŞMA ŞARTLARINI ETKİLEYEN
FAKTÖRLER
3)Deoksinükleotid Trifosfatlar (Deoxynucleotide
Triphosphates=dNTPs)
dNTP konsantrasyonunun yüksek olması yeni
sentezlenen DNA dizilerinde istenilenden farklı
dizilerin (misincorporation) hatalı olarak ortaya
çıkmasına sebep olabilir. Bu yüzden mümkün
olduğu kadar düşük konsantrasyonda dNTP’leri
kullanmak PCR spesifikliğini ve güvenilirliğini
artırmaktadır.
PCR ÇALIŞMA ŞARTLARINI ETKİLEYEN
FAKTÖRLER
4) DNA Zincirinin Açılması İçin Gerekli Zaman ve Sıcaklık
PCR uygulamalarında sistemin çalışmamasının en
önemli sebeplerinden birisi kalıp DNA zincirinin veya
üretilen DNA parçacığının yeterince açılmamasıdır.
Genel olarak DNA moleküllerinin 95 oC de 2 dakika
tutulması zincirin açılması için yeterli olmaktadır.
Fakat GC bazlarınca zengin kalıp DNA zincirlerinde
bu süre ve sıcaklığın fazla olması istenmektedir.
PCR ÇALIŞMA ŞARTLARINI ETKİLEYEN
FAKTÖRLER
5)Primerlerin Açılan DNA Zincirlerine Yapışması
Primerlerin açılan DNA zincirlerine yapışması için gerekli sıcaklık
derecesi ve zaman aralığı primerlerin konsantrasyonu, elde edilecek
DNA’nın uzunluğu ve kullanılan bazların kompozisyonuna göre değişir.
Primerlerin kalıp DNA’ya bağlanması 37- 65 oC sıcaklıklarda
gerçekleşir. Primerler açılan DNA’ya bağlanması sırasında sıcaklığın
artırılması DNA seçiciliğini artırmaktadır. Dolayısıyla primerlerin yanlış
yerlere bağlanması ve hatalı DNA dizilerinin elde edilmesi önlenmiş
olmaktadır.
Özellikle PCR işleminin ilk birkaç devrinde sıcaklığın artırılması
PCR uygulamasının hassasiyetini çok yükseltmekte ve spesifik olarak
beklenen DNA parçacıkları sentezlenmektedir. Sıcaklığın düşürülmesi
primerlerin hatalı şekilde uzamasına ve yeni sentezlenen DNA
dizilerinde hatalı baz bağlanmalarına sebep olmaktadır.
PCR ÇALIŞMA ŞARTLARINI ETKİLEYEN
FAKTÖRLER
6)Primer Uzunluğu, Konsantrasyonu ve Yapısı
Yüksek primer konsantrasyonu primerlerin yanlış
bağlanmasına ve spesifik olmayan DNA bantlarının
üretilmesine sebep olur. Ayrıca primer-dimer
oluşumunu teşvik ederek elde edilecek ürünün
(DNA) az olmasına sebep olmaktadır.
Primerlerin yapışma sıcaklığını hesaplamak için
bir formül geliştirilmiştir. Bu formül Tm= 4 (G+C) +
2 (A+T) şeklinde ifade edilmiştir. Burada Tm
yapışma sıcaklığını, G,C,A ve T ise nükleotid
bazlarını ifade etmektedir.
PCR ÇALIŞMA ŞARTLARINI ETKİLEYEN
FAKTÖRLER
7)Primer uzaması
Primerlerin DNA polimeraz tarafından uzatılması
için gerekli zaman, çoğaltılması hedeflenen kalıp
DNA parçasının uzunluğu, kalıp DNA’nın
konsantrasyonu ve ortam sıcaklığına bağlı olarak
değişmektedir.
Genel olarak primer uzatılma işlemi 72 oC de
yapılmaktadır. Çünkü bu sıcaklık Taq DNA
polimeraz enziminin iyi çalışması için uygun bir
ortam oluşturmaktadır.
PCR ÇALIŞMA ŞARTLARINI ETKİLEYEN
FAKTÖRLER
8)Devir sayısı
PCR’ın çalışma şartları iyi ayarlandığı
taktirde 25-40 devir sayısı yeterli olmaktadır.
Devir sayısının fazla olması spesifik olmayan
bantların ortaya çıkmasına, devir sayısının az
olması üretilen DNA miktarının az olmasına
sebep olmaktadır.
PCR KULLANIM ALANLARI










Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcının ve hastanın tanısında
klinik örneklerde patojen organizmaların saptanmasında
adli tıpta
onkogenesisin araştırılmasında
klonlamada / gen ekspresyon araştırmalarında
DNA dizi analizinde, büyük miktarda DNA örneklerinin
oluşturulmasında
bilinmeyen dizilerin belirlenmesinde
geçmiş DNA'nin incelenmesi ve evrimin aydınlanmasında
Restriksiyon Fragment Length Polimorfizm (RFLP) Analizinde
gen aktarılmış bitkilerin ve DNA baz dizilerinin belirlenmesi
REAL TIME PCR
Son yılllarda PCR reaksiyonlarında sıcaklık
döngüleri sağlamak için kullanılan cihazların
(thermocycler) hassas ölçüm aletleriyle birleştirilmesi, realtime PCR olarak adlandırılan yeni bir yöntemin
gelişmesine neden olmuştur.
Real-time PCR’da ürünlerin analizi reaksiyon
sırasında yapılmaktadır. Bu nedenle, agaroz jel
elektroforezi, DNA bantlarının mor ötesi ışık altında
görüntülenmesi gibi işlemlerin uygulanmasına gerek
kalmamaktadır.
Real-time PCR ürünlerinin kalitatif ve kantitatif
analizlerinde, diziye özgün olmayan floresan boyalardan ya
da diziye özgün problardan yararlanılmaktadır.
REAL-TIME PCR
Real-time PCR Reaksiyon esnasında her bir PCR siklüsünde
yeterli miktarda ürünün verdiği floresans ışığa göre çalışıp
reaksiyonu aşama aşama sonuna kadar oluşan ürünü kontrol
eden bir sistemdir.
REAL-TIME PCR
Işıma özelliğine sahip moleküller kullanarak PCR’ı oluşurken
izleme ve miktar belirleme yöntemidir.
GERÇEK ZAMANLI PCR
Kantitasyon
Erime eğrisi (Tm) analizi
Multipleks uygulaması
KLASİK PCR
PCR sonundaki ürünler (amplikonlar)
saptanır; analiz edilir.
“REAL TIME PCR”
(GERÇEK ZAMANLI PCR)
PCR devam ederken ortaya çıkan ürünler
saptanmaya başladığı anda
değerlendirmeye alınır.
KLASIK PCR’DA PROBLEMLER
Primer seçimi ve dizaynı
 Termalcycler programları
 Reaksiyon şartları
 Zaman alan analiz işlemleri
 Bir testin optimizasyonu
 Agaroz jel elektroforezi, Blotlama
 Kontaminasyon riski

REAL-TIME PCR’IN AVANTAJLARI









Spesifik olmayan amplifikasyonlardan etkilenmiyor
Reaksiyon boyunca veri toplanarak aynı anda analiz
imkanı
PCR sonrası ürünlerin ikincil bir işlemi gerekmiyor
(yüksek verimlilik,düşük kontaminasyon riski)
ultra-rapid siklus (30 dak. to 2 saat)
10¹º katı bulan geniş dinamik aralık
İki kat değişikliği hızla tanımlayabilmekte
Spesifik erime eğrisi analizleri ile spesifik
amplifikasyonların tanımlanması
Duyarlılığı, özgüllüğü ve tekrarlanabilirliği yüksek
Konvensiyonel PCR’dan daha pahalı değil
REAL-TIME PCR’IN DEZAVANTAJLARI




teknik donanım, alt yapı, beceri ve tecrübe
gerektiriyor
Yüksek ekipman ihtiyacı
Aynı ve farklı laboratuvar’lar arasında sonuçlar arası
faklılıklar
Standardizasyon problemi
REAL TIME PCR’IN KULLANIM ALANLARI
Real-time PCR tekniğine dayalı pek çok çalışma yapılmış ve
bu çalısmalarda amplifikasyon ürünlerinin tespitinde kullanılan
tekniklerde şu şekilde belirlenmiştir.
1)Nükleik Asit Boyaları: Bu teknikte, çift zincirli nükleik asitlere baglanan
bir boyanın olusturdugu sinyal, termal cycle üzerindeki optik okuyucu
ile tespit edilir. En yaygın kullanılan boya,SYBR Green I’dir.
2)Moleküler Beacon: Bu molekül uçları birbirine yapışık yaklaşık 25-35
baza sahip saç tokası şeklinde işaretli bir oligonükleotiddir. PCR
sırasında molekül açılarak komplimenter olduğu amplikona bağlanır ve
bu sırada 5’ ucunda bulunan boya serbest hale geçerek floresans bir ışın
yayar.
3)Taqman Probları: SYBR Green I’deki güçlükler ve moleküler
beacon’daki esneklik probleminin giderilmesi amacıyla gelistirilmistir.
Bu teknikte amplifikasyon ürününe spesifik olarak hibridize olan isaretli
bir oligonükleotid (TaqMan probları) polimeraz enzimi ile yıkılınca, 5’
ucunda bulunan boya serbest hale geçer ve yaydıgı ısın, real-time
cihazında kaydedilir.