07. Blotlama Teknikleri

download report

Transcript 07. Blotlama Teknikleri

Blotlama Teknikleri
Southern Blot (1975)
• Bu yöntemde izole edilen DNA uygun bir
restriksiyon enzimi ile kesilir ve belirli sayı ve
uzunlukta DNA frangmentlerinin oluşumu
sağlanır. Agaroz jel elektroforez yöntemi ile jel
üzerinde büyüklüklerine göre birbirinden
ayrılan bu fragmentler önce yüksek pH ile
denatüre edilip blot yöntemi ile nitroselüloz
filtre üzerine geçirilir.
Southern Blot (1975)
•
32p
(ya da başka bir radyoaktif olmayan
nükleotit analoğu) ile işaretli denatüre edilmiş
ve incelenecek bölgeye özgü prob, filte
üzerinde tutulan fragmentler ile uygun
koşullar sağlanarak hibridize edilir. Sonra filtre
üzerine bir röntgen filmi konularak
otoradyografi işlemi gerçekleştirilir. Prob
yalnızca kendisine tümleyici bazları içeren DNA
fragmenti ile hibridize olacak ve otoradyogram
sonucu bu bandın üzerinde gözlenebilecektir.
Western Blot
• Western blot, moleküler biyolojide, bir protein
solüsyonunda, aranan bir proteinin olup
olmadığını ve varsa ne kadar olduğunu
anlamak için kullanılan bir yöntemdir. Özellikle
HIV (+) bulunan örneklerin doğrulanmasında
başvurulur.
Western Blot
• Sds-page uygulandıktan sonra, elektro blotting
yöntemiyle proteinler bir membrana geçirilir.
Daha sonra çeşitli solüsyonlarla işleme tabi
tutulan membrandaki proteinlere spesifik
antikorlar bağlanır. Bu antikorların tespit
edilmesiyle proteinin olup olmadığı, çıkan
bantların kalınlığının kontrol bantlarıyla
karşılaştırılmasıyla da ne kadar olduğu anlaşılır.
Western Blot
Northern Blot
• Bu teknik Southern blot'a çok benzer, ancak bu
yöntemde DNA yerine mRNA veya virüs RNA'sı
kullanılarak işlem yürütülür. Prob olarak,
RNA'ya eşlenik olan işaretli 32p cDNA veya
cRNA'dan yararlanılır. Testin yapılışı ve
değerlendirilmesi Southern blot
hibridizasyonunda olduğu gibi, filtre üzerine
bir röntgen filmi konularak otoradyografisi
gerçekleştirilir. Filtre üzeride RNA-DNA ya da
RNA-RNA hibridizasyonu gerçekleştirilir.
Northern Blot