Transcript Cansu KELEÞ-AFLP DÝZÝLEME VE DNA DÝZÝLEME DENEYSEL

KONU İÇERİĞİ
• AFLP Tanımı
• AFLP Aşamaları
• AFLP Avantajları Ve Dezavantajları
• DNA Dizileme Tanımı
• DNA Dizileme Avantaj & Dezavantajları
• AFLP Ve DNA Dizileme Karşılaştırılması
AFLP (Amplified Fragment Lenght
Polymorphism) Nedir?
(Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizimi)
Genomik DNA’nın restriksiyon enzimi ile kesimi
sonucu oluşan DNA parçalarının bir grubunun
selektif amplifikasyonu (seçici yükseltme) esasına
dayanan bir genotipleme metodudur.
Bu yöntem ‘selective restriction
amplification (SRFA)’ olarak da bilinir.
fragment
Bu yöntem PCR dayanarak 1995 yılında Vos ve ark.
tarafından bulunmuştur,
• RFLP ve PCR kullanımı tekniklerini içerir,
• AFLP kullanılan RFLP den daha hızlı,
• Daha az emek ister ,
• Daha fazla bilgi sağlar,
• RAPD’ e oranlada tekrarlanabilirliği fazladır.
KULLANIM ALANLARI
 Genom haritaları
 Bireysel genotipin tanımlanması
 DNA polimorfizminin saptanması
 Kantitatif özellik lokuslarının saptanması
 Ebeveyn ve akrabaların tespiti
 Hastalık ve genetik defektlerin teşhisi
 Adli tıpta
AFLP tekniği, RFLP tekniğinin
kesme-tanıma kısımlarının PCR ile
çoğaltılmasına dayalı bir DNA markır
tekniğidir.
Çoğaltılan parça uzunluğu farklılığı
veya polimorfizmi anlamına gelen
AFLP tekniği, RAPD tekniğini ile
RFLP tekniğinin birleştirilmiş formu
olup
RAPD
tekniğinin
dezavantajlarını gidermek üzere
geliştirilmiştir.
AFLP, toplam DNA’nın kesildikten sonra PCR
reaksiyonuyla çoğaltılması esasına dayanan güçlü
bir tekniktir.
Bu teknikte genomik DNA genellikle önce birisi
altı, diğeri dört bazı tanıyan iki kesim enzimi (RE)
tarafından kesilir.
Kesilen parçaların uçlarına nükleotid dizilişi
sentetik olan DNA’lar eklenir (Adaptör).
Eklenen sentetik DNA`nın yani
adaptörün
nükleotid dizilişini de taşıyan başlatıcı DNA`lar
yani primerlerin kullanımıyla nispeten spesifik DNA
çoğaltımı yapılır.
Bu çoğaltma iki aşamada gerçekleşir.
İlk aşamada her iki uçtan DNA kesim enzimlerinin
tanıdığı diziden sonraki ilk nükleotide göre seçici
çoğaltımın yapıldığı ön üretim yapılır.
Asıl üretimde ön üretimde elde edilen parçaların
kullanımıyla kesim enzimi tanıma yerinden sonraki
ikinci ve üçüncü nükleotidler için seçici üretim
yapılır.
Bütün başlatıcılar sentetik uçların nükleotid
dizilişini de taşıdığı için üretim oldukça spesifik
şartlarda yapılmış olur.
Üretilen parçacıklar bir baz uzunluğu farklarını
dahi ayırt edebilen poliakrilamid jel üzerinde
hareket ettirilerek farklı genotiplere ait farklılık
gösteren parçacıklar tesbit edilir.
AFLP ANALİZİNİN BASAMAKLARI
 Genomik
Kesilmesi
DNA’nın
Restriksiyon
Enzimleriyle
 Çift sarmallı Adaptör Sekanslarının Restriksiyon
Enzimlerinin kesmiş olduğu kısımlara eklenmesi
 Ön-Seçici PCR
 Seçici PCR
AVANTAJI
 Tek bir reaksiyonda 30-150 bölge
tanımlanabilmesi.
 Sonuçların tekrarlanabilir olması en önemli
avantajını oluşturmaktadır.
DEZAVANTAJI
 Dezavantajı ise pahalı olması,
 Labaratuvar ekipmanına gereksinim duyulması ve
 Dominant markör olmasıdır.
DNA birincil yapılarının tayininde ve nükleotid
baz
diziliminin
belirlenmesinde
kullanılan
yöntemdir. Sıklıkla gen mutasyonları (delesyon,
insersiyon vb.) tespiti yada rekombinant DNA
oluşum yapılarının tayininde kullanılır.
Ayrıca gen regülasyonunda yer alan genetik kontrol
bölgeleri,konsensus dizileri, epistatik genler ve
etkileri belirlenebilmektedir.
DNA dizi analizi, gen yapısı ve genetik kontrol
mekanizmaları hakkında bir çok bilgi edinmemizi
sağlamıştır.
Herhangi bir organizmadan çok miktarda saf DNA
elde edilmesini sağlayan rekombinant DNA
tekniklerinin gelişmesine paralel olarak DNA dizi
analizi yöntemleri de gelişme göstermiştir.
DNA DİZİLEME YÖNTEMLERİ
DNA dizi analizi ya da "Sequencing" DNA'nın
nükleotid dizilerinin saptanması anlamına
gelmektedir.
 İlk dizi analiz çalışmaları 1960’lı yılların başında
75-80 nükleotitlik tRNA’larla başlanmıştır.

DNA DİZİLEME
Nükleotit dizilerinin belirlenmesinde
teknik kullanılmaktadır.
iki temel
 Sanger dideoksi yöntemi
 Maxam-Gillbert kimyasal degredasyon yöntemi
TARİHÇE
DNA’nın 3 boyutlu yapısı, 1953 yılında
tanımlandıktan sonra dizi analiz çalışmalarına
öncülük oluşturacak ilk denemeler küçük RNA
parçaları ile çalışılmış olup, Robert Holley tarafından
1965 yılında tRNA molekülünün dizi analizi
yapılmıştır.
1977 yılında Allan Maxam-Walter Gilbert ve Sanger
tarafından iki farklı DNA dizi analiz yöntemi
bulunmuştur.
Otomatik dizi analiz cihazları 1985 yılından
itibaren geliştirilmiştir.
Her iki teknik de üç temel basamaktan
oluşmaktadır.
 DNA’nın hazırlanması
 Reaksiyonlar
 Yüksek voltajlı jel elektroforezi
DNA DİZİLEME YAPILIRKEN DÖRT AYRI
REAKSİYON KARIŞIMI HAZIRLANIR
Reaksiyonların her
birinde
çok
az
miktarda
modifiye
nükleotit kullanıldığı
için yeni zincir sentezi
rastgele sonlanarak bir
dizi DNA fragmenti
meydana gelir.
MAXAM-GİLBERT YÖNTEMİ
(Kimyasal Kırılma Yöntemi)
Bu yöntemin prensibi hidrazin, dimetil sülfat ya da
formik asitin, DNA’ da bulunan bazları özgül olarak
değiştirmesine ve daha sonra eklenen piperidinin
değişikliğe uğramış nükleotidlerin bulunduğu
noktalardan zinciri kırmasına dayanır.
SANGER-COULSON YÖNTEMİ
(Zincir Sonlandırma Yöntemi)
Bu yöntem enzimatik DNA sentezine dayanır. Bu
yöntemde dizisi saptanacak olan DNA ipliği yeni
sentezlenecek iplik için kalıp olarak kullanılır.
 Bu yöntem için:
 Tek iplikli kalıp DNA’ya
 dNTP’lere
 ddNTP
 DNA polimeraz
 Serbest OH grubu içeren primere ihtiyaç vardır.
AFLP
DNA DİZİLEME
DAHA PAHALIDIR.
DAHA UCUZDUR. ( KULLANILAN
ENZİMLERE BAĞLI )
DAHA UZUN SÜRE ALIR.
DAHA KISA SÜREDE SONUÇ VERİR.
AFLP’ DE ADAPTÖR LİGASYONU VE
SEÇİCİ PCR VAR.
ADAPTÖR LİGASYONU VE SEÇİCİ PCR
YOK. NORMAL PCR VAR.
JEL ELEKTROFOREZİ VARDIR.
JEL ELEKTROFOREZİ VARDIR.
UYGULAMASI ZORDUR.
UYGULAMASI DAHA KOLAYDIR.
AFLP DE KLONLAMA YAPMA DAHA
FAZLADIR.
AFLP YE GÖRE DAHA AZ KLONLAMA
YAPILIR.
İZOLASYON VARDIR
İZOLASYON VARDIR.
KAYNAKÇALAR
 http://www.ebiyoloji.org/biyoloji/makaleler/418-dna-
dizi-analizi-nasil-yapilir?start=5
 www.wikipedia.org
 http://scholar.google.com.tr/