Transcript 12 In Situ Hibritleme

IN SITU MELEZLEME
(HİBRİDİZASYON)
ln situ melezleme (hibridizasyon) (lSH),
• Nükleik asit dizilerinin (DNA ve RNA) morfolojik olarak
korunmuş kromozomlar, hücreler veya doku kesitlerinde
saptanarak gösterilmesini sağlayan ve temel olarak çift iplikli
nükleik asit oluşumu esasını kullanan bir tekniktir.
• lSH’da nükleik asitler kendi hücresel ortamlarında gösterilir.
DNA Zinciri Açılabilir
Merkezi Dogma
• Bir proteinin üretilebilmesi için ilgili genden
mRNA üretilmelidir.
• Eğer bir dokuda ilgilendiğiniz mRNA
üretiliyorsa bu, o dokuda ilgili genin aktif
olduğunu yani genin okunduğunu gösterir.
• mRNA’yı belirleyebilirseniz hangi genin
okunduğunu kolayca anlayabilirsiniz.
Antisense RNA
• RNA zincirinin komplomenteri zincir
Antisens mRNA’lar protein sentezini
durdurmak amacıyla kullanılabilir
Tek zincirli DNA ve RNA nasıl belirlenir?
Kromozom üzerinde hibridizasyon
Etiketler
• Digoxigenin (DIG, Roche)
– Sıklıkla kullanılır
– Antikorlar tarafından belirlenir
• Biotin
– Avidin ile belirlenir
• 2,4-dinitrophenyl (DNP, PerkinElmer)
• Floresans etiketler
Enzimler
• Alkalin fosfataz
– En hassas görüntüleme sistemidir
– Bazı memeli dokularında mevcuttur
– En yaygın substratı: NBT/BCIP (nitroblue tetrazolium / 5bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate), koyu mavi renk
– Floresans substrat: ELF-97 (Molecular Probes)
• Peroksidaz
– Değişik memeli dokularında bulunur
– Yaygın substratı: DAB (diaminobenzidine), kahverengi
Nükleik asitlerin hücredeki yerlerinde
saptanması ne işe yarar?
• Kromozomların fiziksel haritalarının yapılmasında,
• Kromozom yapı ve hatalarının analizinde,
• Kromozomların ve genomun yapı ve işlevinin araştırılmasında,
• Gen anlatımının belirlenmesinde,
•
Eşey tayininde,
• Dokudaki virüs ve bakterilerin tanısında,
• Transformasyon dizilerinin ve onkogenlerin yerlerinin
belirlenmesinde önemlidir.
ISH’ın başlıca aşamaları
1
2
3
4
5
6
• Biyolojik materyalin hazırlanması
• Probun işaretlenmesi
• Probun ve materyalin denetürasyonu
• Melezleme
• Yıkama
• Saptama
• Görünür hale getirme
Materyale Uygulanan Ön İşlemler
Hibridizasyondan önce,
• Probun hedef olmayan nükleik asitlerle melezlenmesini engellemek
• Proteinlerle veya diğer elemanlarla spesifik olmayan etkileşimleri
azaltmak için materyale aşağıdaki işlemler uygulanır:
 RNaz Uygulaması
 Asetilleme
 Dokuyu Geçirgen Hale Getirme (Permeabilizasyon)
 Endojen enzimlerin etkisiz hale getirilmesi
 Melezleme öncesi fiksasyon
RNaz Uygulaması
DNA dizilerini saptamak amacıyla yapılan çalışmalarda
sitoplazma ve nükleusdaki RNA’ların probla melezlenmesini önler
ve endojen RNA’nın temizlenerek istenmeyen zemin
boyanmasını azaltmayı sağlar.
Asetilleme
Bu işlem genellikle RNA/RNA ISH için uygundur.
Trietanolamin+asetik anhidrid uygulamasıyla asetilleme (+)
yüklü molekülleri nötralleştirir ve poli-L-lizin kaplı lamlar
kullanıldığına probun lama özgün olmayan bağlanmalarını önler.
Endojen biyotini de yok eder (Aksi halde zemin boyanmasına
neden olabilir )
Dokuyu Geçirgen Hale Getirme
(permeabilizasyon)
• Proteaz Uygulaması
Proteazlar (pronaz E, proteinaz K, pepsin/HCl) prob ve saptama
belirtecinin dokuya girebilmesine yardım eder.
Hedef nükleik asitleri maskeleyen proteinleri sindirerek etki ederler.
Proteolitik enzim uygulaması dikkatli bir şekilde kontrol edilmelidir.
Konsantrasyon yetersiz olursa normalin aItında melezleme
gerçekleşir; bu durumda konsantrasyon artırılabilir. Morfolojinin
bozulması halinde ise konsantrasyonun düşürülmesi gerekir.
• HCl Uygulaması
Bazı yöntemlerde kullanılır. Kesin etkisi bilinmemekle beraber
proteinlerin ekstraksiyonunu ve hedef dizilerin kısmen
hidrolizini sağlayarak sinyalin artmasına katkıda bulunduğu
düşünülmektedir.
• Deterjan Uygulaması
Diğer işlemlerin lipid ekstraksiyonunda yetersiz kaldığı
düşünüldüğünde kullanılır.
Triton X-100, sodyum dodesil sülfat
Endojen Enzimlerin Etkisiz Hale
Getirilmesi
Prob işaretleyici olarak herhangi bir enzim kullanılmış ise
dokudaki endojen enzim etkisiz hale getirilmelidir. Örneğin,
peroksidaz için, kesitlere % 1 H2O2, alkalin fosfataz için substrat
solüsyonuna levamisol eklenir.
Melezleme Öncesi Fiksasyon
(prehibridizasyon)
Proteaz uygulamasından sonra materyali paraformaldehit ile
tekrar fikse etmek yararlı olur. Melezleme öncesi fiksasyon
hücredeki DNA ve RNA'nın daha sonraki işlemler sırasında
kaybını önlemek için yapılır.
ln situ Melezleme Problarının Seçimi
lSH'da kullanılacak probların seçilmesinde iki temel nokta vardır:
 Prob olarak kullanılacak nükleik asidin tipi
 Uygun işaretleme cinsi
Prob Tipleri
• Prob olarak hazırlanan nükIeik asitler; çift iplikli DNA (dsDNA), tek
iplikli DNA ssDNA), tek iplikli RNA ve oligonükleotidler olarak
sınıflandırılabilirler .
•
Kromozomlar üzerinde gerçekleştirilen lSH'da ve viral DNA
tayinlerinde genellikle DNA probları,
•
mRNA tayinlerinde ise tek iplikli RNA probları veya oIigonükleotidler
tercih edilmektedir.
Problar izolasyon/ klonlama, in vitro transkripsiyon veya kimyasal
sentez yolu ile elde edilebilirler.
Prob Tipleri
DNA probları:
•
Yüksek spesifik aktivite gösterir.
•
Prob olarak kullanılmadan önce denatüre edilmelidir.
RNA probları:
•
RNA-RNA hibridleri en stabil hibridlerdir.
•
RNA probları düşük stabilite gösterir ve RNaz’larla kolaylıkla yok edilebilirler.
Oligonükleotid probları :
•
Dizi hedef diziye tamamlayıcı olarak dizayn edilir.
•
Problar çok stabildir.
•
Küçük boyutundan dolayı hedefe kolayca girebilir.
Prob Uzunluğu
Maksimum melezleme oranı uzun problar ile elde edilir. Ancak lSH'da kısa
problar gereklidir. Çünkü, probun hücre veya kromozomlar çevresindeki
yoğun matriksten geçerek hedefe ulaşması gerekmektedir.
Probların 500 ve üzerinde baz uzunluğuna sahip olanları birçok doku için
en iyi sinyali verir. Çok kısa problar ise çok zayıf sinyal verirler, bazen de
istenmeyen işaretlere neden olabilirler.
Dokunun özelliği, fiksasyon tipi, melezleme öncesi işlemlerinin uygulanıp
uygulanmamasına göre de prob uzunIuğunun seçimi değişir.
OligonükleotidIer tek iplikli oluşları ve çok iyi penetrasyon özelliklerine
sahip olmalarından dolayı lSH için oldukça avantajlı problardır.
Probun İşaretlenmesi
• İzotopik işaretleme
• İzotopik olmayan işaretleme
 İzotopik İşaretleme
• İşaretleme radyoaktif madde ile yapılır ve işaretin belirlenmesi için
otoradyografi kullanılır. Reaksiyon sonucunun hızına, prob stabilitesine ve
çalışılan konuya göre farklı tipte izotoplar kullanılır.
H3 işaretli problar; subsellüler uygulamalar kullanılır, yüksek çözünürlüğe
sahiptir. İşaretli problar birkaç yıl saklanabilir.
S35 lSH'da en yaygın olarak kullanılan radyoaktif işaretlemedir. S35 işaretli
problar, özellikle hücresel uygulamalar için uygundur. Otoradyografi işlemi
1 hafta sürebilir. İşaretli prob birkaç ay içinde tüketilmelidir.
P32, geniş çaplı alanlar için uygulanır. İşaretli problar bir hafta
kullanılmalıdır.
 İzotopik Olmayan İşaretleme,
• İşaretleme radyoaktif olmayan maddelerle yapılır ve işaretin tayini için
immünohistokimyasal yöntemler kullanılır.
İzotopik olanlara göre avantajları,
 İşaretli probların 6 ay veya daha uzun süreli olarak -20°C'da
sakIanabilmesi,
 çözünürlüğün yüksek olması,
 hızlı sonuç alınması,
 daha fazla sayıda işaretleme yöntemi bulunması ve
 daha güvenilir olmasıdır.
Dezavantajları ise; duyarlılığının izotopik işaretlemelerden daha az olması
ve istenmeyen bağlantılara daha fazla yol açabilmesidir.
Prob işaretlemeleri kimyasal veya enzimatik reaksiyonlarla yapılır.
En yaygın kullanılan işaret maddeleri;
İşaret molekülü
BİOTİN
DİGOKSİGENİN
ENZİM
(Peroksidaz, alkalin
fosfataz)
FLUORESEİN
(FITC/ TRITC)
Tayin
Yorum
lSH'da Kullanılan Probların Enzimatik
İşaretlenmeleri
Hapten işaretli problar mRNA lSH için güvenilirlik, yüksek stabilite, hızlı sonuç
verme ve tek hücre çözünürlüğü gibi avantajlara sahiptirler.
En duyarlı yöntem, özgün bir antikora uygun olan bir haptenin, bir nükleotid
türevine bağlanması ile gerçekleştirilir (örneğin, digoksigenin ddUTP veya
dUTp'ye bağlanır)
Melezleme ve yıkamaları takiben doku bir enzime bağlı olan ve hapteni
bağlayan bir protein ile inkübe edilir. Daha sonra sinyal bu enzim için uygun
substratın kullanılması sonucunda, ürünün renklendirilmesi şeklinde elde
edilir.
Bu işlem fluoresein işaret maddesinin kullanımı için de benzer şekildedir.
İşaret fluoresan mikroskobunda gözlenir.
Denatürasyon, Melezleme ve Yıkamalar
 Melezleme Öncesi İşlemler (Prehibridizasyon)
Zemin boyanmasını önlemek için genellikle prehibridizasyon
gereklidir. Prehibridizasyon solüsyonu, prob ve dekstran sülfat
dışında melezleme karışımındaki tüm elemanları içerir.
 Denatürasyon
DNA/DNA ISH için prob ve hedef dizilerin denatürasyonu
gereklidir.
Denatürasyon asit, ısı veya alkali uygulamasıyla yapılır. Alkali
maddeler biotinli problarla kullanılmaz. lsı ile denatürasyon,
uygulamanın basitliği ve daha etkili oluşu nedeniyle en çok
kullanılan yöntemdir.
Denatürasyon işlemleri genellikle morfoloji kaybına neden
olur. Bu nedenle, hedef DNA'nın denatürasyonu prob
denatürasyonuna göre daha kritik bir işlemdir.
 Melezleme (Hibridizasyon)
Prob ve hedef nükleik asitler tek iplikIi hale getirildikten sonra,
DNA/ DNA melezleri için 37°C’ da ve RNA/RNA melezleri için
50-55°C'da bir gece inkübasyona bırakılırlar. Bu sıcaklıklar
genellikte Tm değerinin 20-25°C altındadır.
Radyoaktif lSH'da nükleik asit probunun her kilobazı için 0.10.3 ngµl-1 prob konsantrasyonu önerilmektedir. Prob ne kadar
uzunsa konsantrasyonu da o kadar yüksek olacaktır.
Genellikle radyoaktif olmayan yöntemlerle işaretlenmiş
problar daha yüksek konsantrasyonlarda (klonlanmış problar
için 0.5-2.0 ngµl-1, genomik problar için 1.5-5.0 ngµl-1 )
kullanılır.
İşaretlenmiş nükleik asit probları, formamid, dekstran sülfat,
bloke edici DNA veya tRNA, sodyum dodesil sülfat, sığır serum
albumini ve çeşitli tuzlar içeren bir melezIeme karışımı içine
konur.
•
Formamid, denatürasyon ve melezleme solüsyonlarında
kullanılır. Reaksiyonun doku morfolojisini bozmayacak bir
sıcaklıkta gerçekleşmesini sağlar ve aynı zamanda reaksiyonun
özgünlüğünü de etkiler.
• Dekstran sülfat, melezlenme oranını artırır. Kuvvetli su çekici
özelliği ile melezleme solüsyonunda bir matriks oluşturur. Prob
bu matriksin dışında kalır ve konsantrasyonu artar
•
İşaretlenmemiş bloke edici DNA ve tRNA probun özgün
olmadığı bölgelerde melezlenmesini önlemek için kullanılır.
Bunlar genellikle som balığı sperm DNA'sından elde
edilmektedir. Bu diziler, dokudaki pozitif yüklü elemanlarla
elektrostatik bağlar oluşturur ve prob ile bu tip bağlantıların
oluşma olasılığını azaltır.
• Sodyum dodesil sülfat (SDS), probun dokunun içine girmesine
yardım eder.
• Sığır serum albumini (BSA), probun dokuyla özgün olmayan
etkileşimlerini azaltır.
• Tuzlar, melezleme ve denatürasyon solüsyonlarının iyonik
gücünü ayarlar ve nükleik asit melezlerini sağlamlaştırır.
Melezleme oranı prob uzunluğuna, konsantrasyonuna ve
dizinin kompleksliğine bağlıdır. Genellikle uzun problar
materyal içine difüzyonun güçlüğü nedeniyle daha yavaş
melezlenmeye sebep olur. Melezleme oranı dekstran sülfat
kullanılarak artırılır.
Melezlenme yaklaşık 3-5 saatte tamamlanmakla beraber, bir
gece inkübasyon daha uygundur.
Reaksiyonun kesinliği ve kuvveti
Bir lSH deneyinin kesinliği ("stringency") prob ve hedef nükleik asitteki
hatasız eşleşen nükleotid oranını belirler.
Reaksiyonun kesinliği sıcaklık, iyonik şartlar ve formamid gibi, çift sarmalı
ayıran moleküllerin melezleme karışımı ve melezleme sonrası yıkama
solüsyonlarındaki konsantrasyonu ile kontrol edilir.
Reaksiyon sıcaklığı yüksek ve katyon konsantrasyonu düşük ise bu koşullar
yüksek kesinlik koşullarıdır ve reaksiyonun özgünlüğü artar.
Aksine reaksiyon sıcaklığı azaltılır, yüksek katyon konsantrasyonları
uygulanırsa (düşük kesinlik koşulları) başka homolog diziler ile eşleşme
gerçekleşebilir, yani reaksiyonun özgünlüğü azalır.
Melezlenme Sonrası Yıkamalar (Posthibridizasyon)
Melezleme sonrası yıkamalar zayıf bağlanan probu temizlemek ve sadece
doğru eşleşmiş olanları bırakmak amacıyla uygulanır. Genellikle önce
düşük sonra yüksek "stringency" yıkamaları yapılır. Böylece önce zayıf
melezlenmiş veya melezlenmemiş prob ve melezleme solüsyonunun diğer
elemanları temizlenir; daha sonra tuz konsantrasyonu düşük ve sıcaklığı
yüksek yıkamalar ile probun melezleme özgünlüğü son bir kez düzenlenmiş
olur.
RNA/RNA melezlemesi için ek bir işlem daha uygulanır. RNA probları
yapışmaya eğilimlidir ve bu nedenle yoğun zemin sinyali oluştururlar. Bu
amaçla melezleme sonrası RNaz uygulaması yapılır.
ln situ Melezleme Bölgelerinin Saptanması
Yıkama işleminden sonra melezleme bölgeleri saptanır. Saptama
ve görünür hale getirme yöntemleri probu işaretlemede
kullanılan işaretleyicinin tipine bağlıdır. Radyoaktif işaretli
probların saptanması için otoradyografik yöntemler, radyoaktif
olmayanlar için ise immünohistokimyasal yöntemler kullanılır.
radioactive in situ Hybridization
mRNA
35S
labelled probe
Radyoaktif Olmayan Probların Saptanması
Doğrudan ve dolaylı olmak üzere iki çeşittir.
Doğrudan yöntemde işaret, doğrudan doğruya nükleik asit
probuna bağlanır ve hedef nükleik asitle melezlemeden
hemen sonra mikroskop altında görülebilir. Doğrudan
yöntemlerde prob ile işaretleyici molekül arasındaki bağın
melezleme ve yıkamalar sırasında uygulanan oldukça tahrip
edici koşullara dayanması temeldir. Ayrıca işaretleyici
molekülün melezleme reaksiyonunu engellememesi gereklidir.
Dolaylı yöntemde proba bağlanan işaretleyici molekül
doğrudan doğruya görülemez. Melezlemeden sonra ikinci bir
molekül (haberci molekül) probdaki işaretleyiciye bağlanır ve
böyIece probun melezIenme bölgeleri görünür hale getirilir.
Bu yöntemde de probu işaretleyici molekül, melezleme
reaksiyonunu engellememelidir. Ayrıca haberci molekülün
kolay saptanabilmesi gereklidir.
Radyoaktif olmayan prob işaretlerinin çoğu immünojeniktir ve
immünohistokimyasal yöntemler ile saptanabilir.
En çok kullanılan radyoaktif olmayan işaretler biotin ve
digoksigenindir. Bunlar kendilerine karşı oluşturulan
antikorIar (örneğin, antidigoksigenin) ile saptanabilirler.
Biotin için ise iki saptama sistemi vardır; bunlar anti-biotin
antikorIarı ve biotin-(strept)avidin sistemleridir.
 İmmünohistokimyasal Yöntem
Probla melezlenme bölgeIerinin görülebilmesini sağlayan, sinyal
oluşturan sistemler (haberci moleküller), işarete karşı oluşturuIan
birincil (primer) bir antikora bağlanabilirler.
Bu yönteme tek aşamalı saptama yöntemi denir.
İki aşamalı yöntem ise primer antikorun elde edildiği türe karşı
oluşturulan ikincil (sekonder) bir antikor, haberci molekülü
taşımaktadır.
Bu yöntem tek aşamalı olana göre genellikle daha duyarlıdır. Çünkü
her primer antikora sinyali taşıyan birkaç sekonder antikor birden
bağlanabilir
Biotin - (strept)avidin sistemi
Avidin yumurta akından elde edilen ve biotine karşı aşırı ilgisi olan bir
glikoproteindir.
Haberci molekülü veya sinyali içeren
avidin biotin işaretli proba bağlanır
(1)
Biotinli antiavidin antikoru eklenir
(3)
(2)
Sinyal oluşturucu sistemi içeren
başka bir avidin tabakası eklenerek
sinyal artırılır.
Bu şekilde sinyal ileri derecede artırılmış olur.
Avidinin yerine kullanılabilen streptavidin ise Streptococcus
avidini'den elde edilir. Avidinden farklı oIarak yüksüz bir
moleküldür ve özgün olmayan elektrostatik bağlanmalar daha
az oluşur. Bununla beraber biotine ilgisi avidininkine göre
daha azdır ve daha dayanıksızdır.
Sinyal oluşturan sistemler (haberci moleküller)
Prob melezIeme bölgeIerinin görünür hale gelmesi, antikora veya (strept)
avidine bağlanan sinyal oluşturan sistemlerle (haberci moleküllerle)
sağlanır.
Bu sistemler fluorokromlar, enzimler ve metaller olmak üzere üç temel
gruba ayrılır
17-aminometil-kumarin-3-asetik
izotiyosiyanat
asit; 2fluoresein
• Fluorokromlar
Uygun dalga boyundaki ışıkta fluoresan yayan fluorokromların
streptavidine veya antikorlara bağlanabilen çeşitli tipIeri vardır. En
çok kullanılanlar;
– fluoresein izotiyosiyanat (FITC) yeşil, Teksas kırmızısı ve rodamin
kırmızı,
– amino-metil- kumarin asetik asit (AMCA) ise mavi renkte fluoresan
yayarlar.
• yüksek duyarlılık,
• çözünürlüğün daha iyi oluşu,
• kantitatif çalışmaya uygunluğu
• birden fazla probun aynı anda
saptanması
bu yöntemin üstünlükleridir
morfolojik görüntünün
zayıflığı, sinyalin çabuk solması
nedeniyle sonuçların hemen
fotoğrafla saptama
zorunluluğu gibi bazı
sakıncaları vardır.
• Enzimler
Enzimlerle sinyal oluşturan sistemler, melezleme bölgesinde,
görülebilen bir ürünün çökelmesini sağlayarak işlemektedir.
En çok kullanılan enzimler peroksidaz ve alkalin fosfatazdır.
Enzimlerle saptama yöntemlerinin temel üstünlüğü;
• reaksiyon ürününün dayanıklılığı nedeniyle uzun süre saklanabilen
preparatlara olanak vermesi
• morfoloji daha iyi görüldüğü için melezlerin kesin yerleşimi
belirlenebilmesi
• sinyalin normal ışık mikroskobuyla gözlenebilmesi
KulIanılacak enzimin seçimi materyale bağlıdır. Bazı dokularda
endojen enzimler istenmeyen zemin boyanmasına neden olabilir.
Endojen peroksidazın sorun olduğu dokularda (örneğin, eritrositler,
nötrofiIler, makrofajlar) bu enzimin aktivitesi periyodat ve
borohidrit, sodyum nitroferrisiyanit veya fenil hidrazin ile
önlenebilir.
Endojen alkalin fosfataz ise plasenta ve barsak dokularında
bulunur. Plasenta dokusundaki alkalin fosfatazın aktivitesi, kesitlere
levamisol uygulaması ile, bağırsak dokusundakinin ise % 20 asetik
asit veya 0.2 N HCl ile önlenir.
Yabanturpu (Horseradish)
peroksidaz (HRP) genellikle
sekonder antikora bağlanır (iki
aşamalı yöntem) ve en çok
kullanılan substrat
diaminobenzidindir (DAB).
Reaksiyon sonunda iyi görülebiIen
kahverengi bir çökelti oluşur.
Saptama duyarlılığı
peroksidaz/anti-peroksidaz (PAP)
yöntemi kullanılarak artırılabilir.
PAP; HRP iIe antikorun oluşturduğu
bir komplekstir.
Alkalin fosfataz için, BClP/NBT (5-bromo-4-kloro-3-indolil
fosfat/nitroblue tetrazolium) reaksiyonu oldukça duyarlıdır. Bu
reaksiyon sonucu prob melezleme bölgeIerinde mavi
bir çökelti oluşur. PAP kompleksine benzer şekilde kullanılan
alkaIin fosfataz/anti-alkalin fosfataz (APAAP) kompleksi, prob
saptama duyarlılığında artış sağIar.
non-radioactive in situ Hybridization
DIG:
AP:
Digoxigenin (Hapten)
Alkaline Phosphatase
DIG labelled probe
mRNA
anti-DIG
purple
precipitate
AP
BCIP + NBT
Geffers, L.
situ Hybridization with TSA
DIG:
POD:
AP:
DIG labelled probe
mRNA
Digoxigenin (Hapten)
Horseradish Peroxidase
Alkaline Phosphatase
anti-DIG POD
Tyramid
Biotin
Tyramid
Biotin
Tyramid
Biotin
Tyramid
Biotin
Tyramid
Neutravidin
purple
precipitate
Biotin
AP
BCIP + NBT
Geffers, L.
• Metaller
lSH için en çok kullanılan metal kolloidal altındır. Bu metal
streptavidin ve antikorlara bağlanmış olarak kullanılır ve hem ışık
hem de elektron mikroskop düzeyinde görülebilir.
lşık mikroskobu düzeyinde, altın probları ile saptamanın duyarlılığı
gümüşle çoğaltma yöntemi ile artırılabilir. Elektron mikroskop
düzeyinde kolloidal altının enzimlerle oluşturulan çökeltilere göre
birçok üstünlüğü vardır.
Farklı büyüklükte altın tanecikleri birlikte kullanılarak aynı anda
birden fazla dizi saptanabilir. Bu metal tek tek yuvarlak tanecikIer
halinde gözlenebildiğinden bunların sayılması ile kantitatif
değerlendirme imkanı vardır. Ayrıca sinyal en yüksek çözünürlükte
saptanır.
Fakat bu yöntemin duyarlılığı diğer saptama yöntemlerine göre daha
azdır.
Ferritin ve hemosiyanin gibi diğer metallerle saptama yöntemleri de
vardır. Ancak bunların boyutları kolloidal altın kadar iyi kontrol
edilemediğinden daha az kullanılırlar.
ln situ Melezlemede Kontrol
ISH deney sonuçlarının doğru olarak yorumlanabilmesi ve güvenilirliği
açısından çok dikkatli davranılmalı ve işlem sonuçlarından emin olmak
için çeşitli kontroller yapılmalıdır.
Spesifik olmayan prob bağlanma kontrolü
Tayin ayıraçlarıyla kontrol
Üretkenliğin kontrolü
Hedef dağılımın kontrolü
Melezleme reaksiyonlarında, problar ile hedef olmayan
nükleik asit dizileri arasında, olası homolojilerden dolayı
istenmeyen sonuçlar ortaya çıkabilir. Ayrıca probun G-C
bakımından zengin bölgeleri ile hedef olmayan nükleik asitler
arasındaki melezleme de yanlış pozitif sonuç verebilir. Böyle
hatalı melezleme reaksiyonlarının önlenmesi için prob
dizisinin çok dikkatli seçilmesi ve kontrol probların kullanılması
gereklidir.
Melezleme öncesi uygulamalarda yer alan RNaz veya DNaz ile
sindirme DNA veya RNA gibi hedef nükleik asitlerin varlığının
saptanmasında önemli bir kontroldür. Enzim uygulamaları çok
dikkatli yapılmalıdır. Nükleaz uygulamasından sonra hedef
nükleik asitin ortadan kaldırılmasını takiben, eğer enzim
dokudan tam olarak giderilememiş ise daha sonraki aşamada
probu da sindireceğinden melezleme sinyali gözlenemez.
İstenmeyen meIezleme sinyallerinin bir kısmı da probların spesifik
olmayan hücresel bölgelere bağlanması ile ortaya çıkabilir. Bu duruma,
proteinler ile prob arasındaki elektriksel çekimler yol açabilir. Bir diğer
prob-protein ilişkisine DNA'ya bağlanan proteinler neden olabilir. Bu gibi
özgün olmayan ilişkiler, hücresel nükleik asitlerle melezlenmeyen negatif
kontrol problar kullanılarak ortadan kaldırılabilir.
Bunlara ek olarak, histokimyasal veya immünohistokimyasal tekniklerdeki
bir hata yanlış pozitif sonuçlar doğurabilir. Bu da prob içermeyen
melezleme tamponu ile inkübe edilen kesitlere işaret tayin sistemlerinin
uyguIanması ile kontrol edilebilir. Ayrıca immünolojik tayin sistemlerinde
kullanılan enzimlerin, dokuda endojen olarak varlıkları dikkate alınmalı;
gerekirse bir başka enzim seçilmeli ya da prehibridizasyon aşamasında
endojen enzim maskelenmelidir.
Kontrol probları olarak sense veya antisense oligonükleotidler,
ayrıca rastgele dizili oligonükleotidler ve oligo d(T) veya d(A)
kullanılabilir. Oligo d(T) probları, dokudaki mRNA'nın
korunmuşluğu ve hücresel aktivitesi hakkında önemli bilgi veren
poliadenil RNA'ları tayin etmek için kullanılır.
Bu aynı zamanda lSH protokolünün optimizasyonunda kullanılan
bir adımdır.
In Situ Melezlemede Ortaya Çıkan Sorunlar ve
Çözümleri
Sorun
1) Kesitlerin
düşmesi
2) ISH reaksiyon
işaretlerinin
yokluğu veya azlığı
Olası nedenler
Çözüm
Sorun
2) ISH reaksiyon
işaretlerinin
yokluğu veya azlığı
3) Kesitte özgün
olmayan, çok fazla
işaret olması
(istenmeyen zemin
boyanmaları)
Olası nedenler
Çözüm
ISH Protokolü
(Eichele Lab.’ın protokolünden)
1. Örneklerin hazırlanması ve dokunun fiksasyonu,
2. Ön hibridizasyon işlemi, probların ilavesi ve hibridizasyon
işlemi,
3. Son hibridizasyon işlemi ve spesifik olmayan bağlanmaların
giderilmesi, slaytların bir seri çözeltiden geçirilerek fikse
edilmesi ve üzerlerinin lamelle kapatılması, örneklerin
mikroskopta incelenip uygun olanlar taranarak genel
kullanım için internet ortamına aktarılması.

Slâytların sandviç şeklinde hazırlanmasında kullanılan özel camlar bir gece
180°C sıcaklıktaki fırında bekletilir.

Kullanılan bütün çözeltilerin büyük bir kısmı otoklavlanır veya özel
şekillerde hazırlanır.

RNA’ları korumak için DEPC’li su kullanılır ve böylece RNase’a karşı korunur.

Fare embriyosu fareden alındıktan sonra OCT (optimal freezing medium)
içine gömülür. Bu amaçla özel alaşımlı kablar kullanılır. Bu özel kablar içine
konulduktan sonra ani dondurmayla dondurulan embriyo -70°C saklanır.
 Mikroton cihazı kullanılarak lamlar üzerine fare embriyoları Cryosections
cihazıyla 20 µm kesitler halinde yayılır.
Slaytlar robota yerleştirilir ve Prehibridizasyon işlemi yapılır.
Hibridizasyon işlemi yapılır.
NBT/BCIP kullanarak renk reaksiyonu uygulanır.
İşlemler robotto otomatik şekilde yapılır. Cihaz bilgisayar programı ile
kontrol edilir.
Slâytların hazırlanma şekli
(sandviç); slâyt resminde slâyt ile
kullanılan cam arasındaki boşluk
80 μm
İn situ hibridizasyon işlemlerinin basamaklar halinde gösterilmesi
Prehybridization/Hybridization
fresh frozen tissue sections are fixed in 4% PFA , acetylated and dehydrated
before they are used on the robot
cycles
5
7
2
4
1
2
7
2
7
2
1
1
T (min)
5 min.
5 min.
5 min.
5 min.
5 min.
10 min.
5 min.
10 min.
5 min.
15min
15 min.
330 min
volume
300
300
300
300
400
300
300
300
300
300
300
Reagent
H2O2 in MeOH
PBS (1)
0.2M HCl
PBS (2)
PK buffer
Proteinase K in PK buffer
PBS (3)
4% PFA (1)
PBS (4)
hyb-mix (1)
heat up to 64º C
probe hybridization
Robot
l. class
ethanol
water
water
water
water
water
water
water
water
hyb-mix
hyb-mix
probe
container
325
1000
200
1000
200
200
1000
200
1000
200
300
temperature
24º C
24º C
24º C
24º C
24º C
24º C
24º C
24º C
24º C
24º C
64º C
64º C
Geffers, L.
Posthybridization
cycles
5
5
5
3
1
T (min)
5 min.
10 min.
12 min.
8 min.
8 min.
volume
300
350
350
300
300
Reagent
5 x SSC
formamide I
formamide II
0.1 x SSC (1)
0.1 x SSC (2)
l. class
water o/n
water o/n
water o/n
water o/n
water o/n
Robot
container
450
450
450
450
450
temperature
62º C
62º C
62º C
62º C
24º C
Geffers, L.
Immuno and TSA
cycles
4
6
4
2
6
4
2
2
2
2
2
2
3
4
4
2
6
1
6
2
6
4
T (min)
5 min.
5 min.
5 min.
5 min.
5 min
5 min.
10 min.
5 min.
5 min.
10 min.
5 min.
5 min.
5 min.
5 min.
10 min.
30 min
5 min.
25 min
5 min.
20 min
5 min.
5 min.
volume
300
300
300
300
300
200
300
200
300
350
300
250
350
200
300
350
200
250
250
350
250
250
Reagent
NTE (1)
20 mM iodoacetamide (1)
NTE (2)
TNT (1)
4% sheep serum (1)
TNT (2)
TNB blocking buffer
TNT (3)
maleate wash buffer (1)
blocking reagent
maleate wash buffer (2)
TNT (4)
TMN
TNT (2)
TNB blocking buffer
antiDIG-POD
TNT (3)
tyramide-biotin
maleate wash buffer (1)
Neutravidin
maleate wash buffer (2)
TNT (4)
l. class
water o/n
water o/n
water o/n
water o/n
water o/n
water o/n
water o/n
water o/n
water o/n
water o/n
water o/n
water o/n
water o/n
water o/n
water o/n
water o/n
water o/n
water
water
water
water
container
1000
325
1000
1000
325
1000
325
1000
1000
200
1000
1000
325
1000
325
200
1000
1000
200
1000
1000
temperature
24º C
24º C
24º C
24º C
24º C
24º C
24º C
24º C
24º C
24º C
24º C
24º C
24º C
24º C
24º C
24º C
24º C
24º C
24º C
24º C
24º C
24º C
Robot
Geffers, L.
Color Reaction
cycles
2
3
3
1
1
3
T (min)
5 min.
10 min
x
x
10 min.
x
volume
400
350
400
300
200
400
Reagent
TMN
BCIP/NBT
System liquid (1)
NTE (3)
4% PFA (2)
System liquid (2)
l. class
water
water
System liquid
water
water
System liquid
container temperature
325
24º C
200
24º C
24º C
1000
24º C
200
24º C
24º C
Robot
Geffers, L.
Slâytlar bir gece bekledikten sonra slâyt kaplama makinesinde yüzeyleri
kaplanarak kurutulur. Daha sonra slâytlar mikroskopta incelenir ve sonra
taranarak bilgisayar ortamına alınır.
C
A): Slâyt kaplama makinesi, (B): Slâytları incelemede kullanılan mikroskop, (C): Slâytların taramasının yapıldığı scanner cihazı
Geffers, L.
Gene Expression
E14.5
Trp63
Runx1
MyoD
Slc25a37
P7
Pax6
Geffers, L.
Atlas Building
Geffers, L.
In situhybridization of BDNF, c-Fos and Arg3.1/arc in
adult rat cochlea and AC. - HRP-DAB System
Tan, J. et al. Neuroscience
in situ hybridization with a 35S-radioactive
Yamamoto, N. et al. Neuroscience
Bütün Halinde Hazırlanan Preparatlar
(whole mount ISH)
Bir organizmanın tümünü (örneğin Drosophila embriyoları,
bezelye embriyoları vb.) araştırmak iç̧in, 1 -2 mm büyüklüğündeki
parçalar fikse edilir.
Bu şekilde hazırlanan preparatlarda prob ve saptama belirtecinin
materyale girmesinde karşılaşılan sorunların aşılması için
örneğin; bitki hücreleri selülaz ve pektinaz gibi hücre duvarını
sindiren enzimler ile ön işleme tutulabilir .
whole mount ISH protokolü
zebrafish embryos
Thisse, C. and Thisse, B. (2008) High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. protoc. 3: 59 – 69
Thisse, C. and Thisse, B. (2008) High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. protoc. 3: 59 – 69