Transcript 04. Biyoteknolojide Kullanılan Yöntemler

Biyoteknolojide Kullanılan
Yöntemler
Protein Saflaştırmada Yapılan
İşlemler
Hücrelerin Parçalanması
•
•
•
•
Tekrarlı dondurma ve eritme (Örn: Sıvı azot)
Sonikasyon (Ultrason),
Mekanik Parçalama (Blender)
Organik çözücülerle hücre zarının
geçirgenleştirilmesi
• Deterjanlarla muamele
Ultrasonla Parçalama
Ultrason ile zayıflamak mümkün mü?
Mekaniksel Parçalama
Çöktürme ile kısmi saflaştırma
•
•
•
•
•
•
Amonyum sülfat çöktürmesi
İzoelektrik çöktürme
Organik çözücülerle çöktürme
Asit ile çöktürme
Isı yoluyla çöktürme
Triton X-100 veya CHAPS ile membran
proteinleri sökülebilir. SDS proteinleri
denatüre ettiği için bu amaç için kullanılmaz.
Santifüj
• Santrifüj ile karışımda asılı kalan maddelerin
daha hızlı çökmesi salanır.
• Ultra santrifüj kullanılarak mitekondriler bile
çöktürülebilir.
Diferansiyel santrifüjleme. Homojenat,
gittikçe artan santrifüj kuvvetine
maruz bırakılarak fraksiyonlara ayrılır.
Denge yoğunluk gradient santrifüj
yöntemi
Diyaliz
• Protein saflaştırmasının çeşitli aşamalarında
proteinlerin küçük moleküllerden ayrıştırılması
için kullanılan bir işlemdir. Örneğin, amonyum
sülfat ile çökeltmenin ardından kullanılacak bir
iyon değişim kromatografisi (bkz. aşağıdaki
bilgili bölüm) adımı için bu tuzun giderilmesi
gerekir, bunun için diyaliz yapılır.
Diyaliz
• Diyalizde, yarı geçirgen bir membran kullanılır,
porlu bir selüloz membran gibi. Porların
büyüklüğü proteinlerin geçmesine izin vermez
ama küçük moleküller ve tuz iyonları geçebilir.
Diyaliz
• Diyaliz edilecek protein
karışımı bir dializ
torbasına konur, torba da
büyük hacimli bir tampon
çözeltisi içine yerleştirilir.
Birkaç saat sonra
torbanın dışındaki ve
içindeki çözelti
dengelenir, iki taraf
küçük moleküller
bakımından aynı bileşime
sahip olur.
Diyaliz İşlemi ile tuzların
uzaklaştırılması
Diyaliz sistem dengeye ulaşıncaya
kadar devam eder
Jel filtrasyon kromatografisi ile de
tuzlar uzaklaştırılabilir
Kromatografik Yöntemler
• Protein Saflaştırılmasında genellikle kolon
kromatografisi kullanılır. Bunlar:
– Afinite kromatografisi
– İyon değişim kromatografisi
– Jel filtrasyon kromatografisi
• Kromatografi, bir karışımdaki maddelerin bir
sabit faz üzerinde farklı hızlarda sürüklenmesi
sonucunda birbirinden ayrılması temeline
dayanır.
• Maddeleri sürükleyen ise bir sıvı ya da gaz
olabilir
• Karışımdaki maddeler sabit faz tarafından ne
kadar alıkonuyorsa o oranda yavaş ilerler.
• Örneğin; sıkışık bir trafikte taksiler durmuş
iken motosikletlerin daha hızlı ilerlemesi gibi…
• Ya da trafik kontrolünde taşıtlar durdurulurken
yayaların ilerlemesi gibi…
Uygulama Şekline Göre
• İnce Tabaka Kromatografisi
• Kolon Kromatografisi
Sabit faz, saflaştırılmak istenen maddenin
cinsine göre değişir. Bu sabit fazı genellikle
hem ince tabaka hem de kolon
kromatografisine uygulayabiliriz. Tercih size
kalmış.
İnce Tabaka Kromatografisi
• Sabit Faz
Başlangıç
Hareketli Faz
s olvent front
c omponent B
Less polar!
c omponent A
More polar!
s olvent front
c omponent B
c omponent A
orig in mixture
s olvent front
orig in
orig in
• Rf değeri aynı şartlarda bir
madde için aynıdır.
• Rf ayırt edici bir özelliktir.
Elinizdeki karışımda,
şüphelendiğiniz maddenin
olup olmadığını İTK ile
anlayabilirsiniz.
Ayrılan noktayı kazıyıp
maddeyi saf olarak da elde
edebilirsiniz.
A
B
unknow n
Kolon Kromatografisi
Principles of Separation on a column
Principles of Separation
Principles of Separation
Principles of Separation
Principles of Separation
Principles of Separation
Principles of Separation
• Kolon kromatografisi uygulanan tekniğe göre
değişik alt bölümlere ayrılabilir.
– İyon değişim kolonu
– Jel filtrasyon kolonu
– Afinite kolonu
– Hidrofobik etkileşme kolonu
İyon Değişim Kromatografisi
Kolondaki sabit faz
çalışılan pH’da + ya da – bir
yüke sahiptir. Sabit fazla zıt
yükle yüklü olan maddeler
kolonda alıkonurken aynı
yükte olanlar alıkonmazlar.
Jel Filtrasyon Kromatografisi
ŞOK! ŞOK! ŞOK!
Daha büyük
moleküller daha
hızlı ilerler.
Afinite Kroma..
Specific interactions
Afinite Kromatografisi
Sabit faza öyle bir
molekül tutturulur ki;
sadece ilgilendiğimiz
molekülle etkileşir ve
onu kolonda tutar.
Afinite kromatografisinde gerekirse
uzatma kolu kullanılabilir
• Kromatografi bir çok analiz cihazının kullandığı
saflaştırma tekniğidir. Bunlardan sıklıkla
kullanılan ikisi:
– HPLC
– Gaz Kromatografisi
HPLC
Hewlett-Packard
Series 1100 HPLC
Çözücüler
Pompa
Enjektör
Kolon
Dedektör
HPLC
HPLC ŞEMA
HPLC
HPLC Chromatogram of Standard 1
0.500 x 10-4 M caffeine
HPLC
HPLC Chromatogram of Standard 2
1.00 x 10-4 M caffeine
HPLC
Gaz Kromatografisi
Gaz Kromatografisi
Protenleri derişikleştirme
A. Ultra Filtrasyon
Protenleri derişikleştirme
B. Liyofilizasyon
Elektroforez
1D elektroforez
 Doğal elektroforez (Poliakril amid, Agar)
 SDS-PAGE (Sodyum Dodesil Sülfat
Poliakril Amid Jel Elktroforezi)
2D elektroforez
Elektroforezin Temeli
Dikey Elektroforez Proteinleri
Ayırmada Kullanılmaktadır
Dikey Elektroforez
SDS’nin (Sodyum Dodesil Sülfat) Etkisi
Elektroforezden sonra boyama yapılır
Boyamadan sonra ise yıkama yapılır
SDS-PAGE ile Mol Kütlenin Bulunması
Yatay Elektroforez Nükleer Materyalleri
Ayırmada Kullanılmaktadır
Yatay elektroforezde jel olarak agar
kullanılır
Nükleer Materyallerin Elektroforez ile
Ayrılması
İzoelektrik Fokuslama
2D Elektroforez
2D Elektroforez
DNA İzolasyonu
Malzemeler
1. Lizis solüsyonu
0.5 M Tris-HCl pH 8.0,
20 mM EDTA
10 mM NaCl
1% SDS
0.5 mg/mL proteinase K
2. Doygun NaCl (6M)
3. Etanol (%96, %70)
DNA İzolasyonu Uygulama Basamakları
• Hazırlanan lizis solüsyonundan hücre peletinin
üzerine 2 mL eklenir. 37°C ‘de bir gece bekletilir.
• 1 mL doygun NaCL eklenir.
• Örnekler 55°C 10 dakika bekletilir.
• 30 dakika 500 g’de santrifüj edilir.
• Alttaki protein bölümüne dokunmadan
süpernatant yeni bir tüpe aktarılır.
• Süpernatantın 2 katı hacimde soğuk %96’lık
etanol eklenir. Tüp defalarca alt üst edilerek
DNA’nın çökmesi sağlanır.
DNA İzolasyonu Uygulama
Basamakları
• Çöken DNA plastik spatula yada santrifüj ile alınarak yeni bir tüpe
aktarılır.
• Santrifüj yapılacak ise 10.000 g’de 10 dakika santrifüj edilir. Üstteki
alkol fazı atılır.
• %70’lik alkol ile DNA bir kez yıkanır. Bunun için 1mL %70’lik alkol
eklenir. Tüp alt üst edilir. 10.000 g’de 10 dakika santrifüj edilir.
Üstteki alkol fazı atılır.
• DNA havada kurutulur.
• Distile suda DNA çözülür. Çözülmesini kolaylaştırmak için 65 0C’de
10 dakika tutulur.
• Elde edilen DNA dan 1/25 -1/40 dilüsyon hazırlanır. A280 / A260
oranı ölçülür (oran >1.5 olmalıdır). 280 nm’deki absorbans önce 50,
sonra da dilüsyon faktörü ile çarpılır. Sonuç μg/mL olarak DNA
konsantrasyonunu verir.
Enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA)
• Antijen-antikor ilişkisini,
antikora bağlanmış bir enzimin
aktivitesini araştırmak temeline
dayanan kantitatif ölçüm
yöntemidir. Antijene karşı
antikor ya da antikora karşı
antijen aramak mümkündür.
Virüs ve parazit
enfeksiyonlarında kullanılan bir
tanı yöntemidir.
Sandviç ELISA
Sandviç ELISA
Sandviç ELISA
Sandviç ELISA