Transcript dna pürifikasyonu

DNA
PÜRİFİKASYONU
DNA

Genetik bilgiyi taşıyan
çift sarmal moleküldür.

5C’lu şeker, fosfat ve bazları
içeren nükleotidlerden oluşur.

Doğadaki canlıların tümüne
yakın kısmında genetik materyal DNA’dır.
DNA hücre içerisinde:

Çekirdek
 Mitokondri
 Kloroplastlarda
bulunmaktadır.
 DNA hücre içersinde serbest halde bulunmaz. Belli
bir organizasyonu vardır. DNA nın çok büyük bir kısmı
nukleusta , bir miktarı ise mitokondri ve kloroplastta
bulunur.
DNA molekülleri nukleuslarda da serbest halde
bulunmazlar. DNA kromatin iplikçikleri ve sonrada
kromatinleri verecek şekilde özel bazı proteinler ve
RNA ile bir kompleks yapı meydana getirir. Kromatin
yapı taşı ;DNA, histon proteinler,histon
olmayan proteinler,HMG proteinler ve RNA dan
meydana gelmiştir.
***High Mobility Group- hareket yeteneği
yüksek grup olarak adlandırılan proteinler
Bazı kimyasal maddeler ve enzimler ile canlı hücrelere
ait hücre zarı veya canlı hücre duvarının yıkılıp DNA nın
ortaya çıkarılmasına DNA saflaştırılması denir.Buda
yukarıda bahsedilen yapıların (histon proteinler,non-histon
proteinler,HMGler) hepsinin uzaklaştırılması durumudur.
DNA PÜRİFİKASYON YÖNTEMLERİNDE BİRBİRİNİ
İZLEYEN ÜÇ TEMEL AŞAMA BULUNMAKTADIR:
1- Hücrenin parçalanması ile yüksek molekül
ağırlıklı DNA’nın açığa çıkması,
2-Denatürasyon veya proteoliz ile DNA-protein
kompleksinin ayrılması ve DNA’nın çözünür
duruma getirilmesi,
3-DNA’nın basit enzimatik ve/veya kimyasal
yöntemlerle proteinler, RNA ve diğer
makromoleküllerden ayrılması,
BAŞARILI BİR DNA
SAFLAŞTIRILMASI
İÇİN
1-Hücresel organellerin açığa çıkması için
hücre duvarı kırılmalıdır
İlk aşama duvarın
zayıflatılmasıdır.Fiziksel olarak
dondurup çözme yada kimyasal
maddeler kullanılarak yapılır.
2-Hücre membranı parçalanmalıdır.
Bu sayede DNA ekstrasyon buffer
içinde serbest kalır.Bu genelde SDS
gibi deterjanların kullanılması ile olur.
3-DNA nükleazlardan korunmalıdır.
EDTA gibi deterjanlar bu yüzden
kullanılır.
4-DNA protein kompleksinin çözünmesi.
Buffer/doku karışımına kloroform
veya fenol karışımı eklenerek
DNA’dan proteinlerin ayrılması
sağlanır.
5-DNA’nın kırılması en aza indirilmeli.
Solusyon içersindeki DNA çalkalanarak bile kırılabilir.
6-DNA’nın ortamdaki diğer moleküllerden ayrılması.
Genelde bu aşama DNA’nın fiziksel yada kimyasal
etkilere maruz kalması ile sağlanır.Örneğin DNA kimyasal
olarak çöktürülebilir.Bu işlemde en çok kullanılan
kimyasal etanol’dür.Fiziksel uygulamada santrifüj
yapılır.Santrifüj hızı ve zamanı ayrılması istenilen
molekülün ağırlığına göre değişkenlik gösterir.






Enzimler(RNase) RNA’yı yok etmek için,
Enzimler (Proteases) DNA molekülüne bağlı
olarak bulunan proteinleri yok etmek için,
İzopropanol ve etanol: Nükleik asitlerin
çöktürülmesinde,
Amonyum sülfat ve sodyum sülfat:Proteinlerin
çöktürülmesinde,
Etil asetat, Toluen, SDS membran yapısını
bozmada,
Saflaştırılan DNA +4°C’da uzun süre
saklanabilir.
Bakterilerden
Mayalardan
Kromozom
DNA’sının
Saflaştırılması
Memelilerden
Bitkilerden
Bakterilerden kromozom(genom)
DNA’sı pürifikasyonu:
Organizma: E. coli , B. Subtilis
LB(Luria Bertani) besiyerine tek koloniden ekim yapılır ve 150
devir/dakika hızda, 37°C’de bir gece bekletilir.
Bakteri kültürünün 1.5 ml’si 10.000 rpm de 5 dakika santrifüj edilir.
Süpernatant atıldıktan sonra Tris – EDTA (TE ph:8) tamponu içinde
çözündürülür
Çözelti üzerine Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) ve proteinaz K eklenir
ve 37°C’de 1 saat bekletilir (bu aşamada hücreler parçalanır).
Üzerine NaCI ile NaCI/CTAB (setil trimetil amonyum bromür) çözeltileri
eklenerek 65 °C’de 10 dakika bekletilir.
Eşit hacimde kloroform/izoamil alkol (CIA) eklenerek 10.000 rpm’de 5
dakika santrifüjlenir.
Süpernatant alınarak üzerine fenol/kloroform/izoamil alkol eklenerek
10.000 rpm’de 5 dakika santrifüjlenir.
Süpernatant ayrı bir tüpe alınarak izopropanol eklenir ve DNA
çökünceye alt-üst edilerek karıştırılır.(Bu aşamada DNA’nın iplikçikler
şeklinde çökeldiği gözlenir)
DNA, 15.000 rpm’de 10 dakika santrifüjlenir
Pelletin üzerine etanol eklenerek DNA yıkanır ve alkol geri
boşaltılır.
Tüpün ağzı açık durumda oda sıcaklığında (10-15 dak.) ya da
60 °C’de birkaç dakika bekletilerek alkol tamamen uçurulur.
Çökelti Tris-EDTA (pH:8) içinde yavaşça vurularak çözündürülür.
PÜF NOKTALAR:

Bitki hücreleri genelde çok sayıda sekonder
bileşik içerir, bunun sonucu olarak belirli türlerde
yüksek düzeydeki sekonder bileşikler DNA’nın
saflığını bozmaktadır.Bu sorunun üstesinden
gelmek içinalternatif ekstrasyon bufferleri
kullanılır.

DNA ekstrasyon
bufferlerı ph
8.0 hatta ph
9.0 civarında
olmalıdır
Kromozom
dışı DNA’nın
saflaştırılması
Plazmid
Organel
Kromozom dışı DNA’nın izolasyonu
Kromozom dışı DNA olarak bakterilerde
plazmid adı verilen, sitoplazmada genom
DNA’sından bağımsız replikasyon yapabilen,
çift zincirli, genellikle halkasal(ender olarak
doğrusal) olan DNA molekülleri bulunmaktadır.
 Ökaryotlarda ise nukleus DNA’sından bağımsız
kalıtım gösteren organel DNA’larına mitokondri
(mtDNA) ve kloroplastlarda (ctDNA)
rastlanmaktadır.
 Mitokondri ve Kloroplast DNA’sı, çift zincirli
halkasal bir molekül olamakla birlikte boyutu
organizmalara göre değişmektedir.

Plazmid DNA’sı İzolasyonu

Plazmitlerin
rekombinant DNA
teknolojisi
çalışmalarında
taşıyıcı DNA(vektör)
olarak geniş çapta
kullanılması plazmid
izolasyon
yöntemlerinin
gelişmesine yol
açmıştır.
Organel DNA’sı izolasyonu

Organel DNA’sı izolasyonlarında en önemli
aşama öncelikle organelin parçalanmamış
şekilde ayrılması olduğundan dolayı,bu
olay 2 aşamada gerçekleştirilir.
***Organelin izolasyonu
***Organel DNA’sının izolasyonu
Mitokondriyal DNA’nın
saflaştırılması


Mitokondri İzolasyonu
Materyal: Somatik hibritlerin çeşitli bitki
dokuları
Taze dokular (yaprak, çiçek vb.)
buzda soğutulmuş uygun tampon
içinde parçalanır
yada
Patates tuberi elektrikli meyve
suyu sıkacağından geçirilir ve eşit
hacimde uygun tampon eklenir.
Naylon bir membrandan filtre
edildikten sonra büyük hücre
parçalarının uzaklaştırılması için
500×g’de 10’ dakika santrifüj edilir.
Plastitlerin uzaklaşması için
süpernatant 2600 ×g’de 15’ da 2
kez ve bir kez de 10’ santrifüj
edilir.
Süpernatant alınır ve
mitokondrileri çöktürmek için
14.500 ×g’de 15’ santrifüj edilir.
Lizis olmuş nükleus parçalarını
içeren üst sıvı atılır, mitokondrileri
içeren çökelti buzda soğutulmuş
uygun tampon içinde
çözündürülür.
Mitokondri çökeltisi sıvı azotta
dondurulduktan sonra -80°C
saklanır yada doğrudan DNA
izolasyonu yapılabilir.
Mitokondri DNA’sı izolasyonu
Mitokondri çökeltisi lizis
tamponu içerisinde
çözündürüldükten sonra
Proteinaz K eklenerek
37°C’de 1 saat bekletilir.
Amonyum asetat ve TE
ile doyurulmuş
fenol/kloroform
eklenerek 12.000rpm’de
5’ santrifüj edilir.
18.000×g’de 20’
santrifüjlemeden sonra
çökelti distile su içinde
çözündürülür
Süpernatant kısmı ayrı
bir tüpe alınarak absolü
etanol alınarak
eklenerek -20 °C’de bir
gece bekletilir.
ANİMASYON
SORULAR
?