Transcript Temel Sitogenetik ve Nomenklatür

Temel Sitogenetik ve Nomenklatur;
Dünden Bugüne Kromozom Analizleri
Prof. Dr. Seher Başaran
İstanbul Üniversitesi, İstanbul Tıp
Fakültesi, Tıbbi Genetik AD
Sitogenetiğin Tarihçesi
•
Kromozom,yunanca “renkli cisim” (“chroma + soma”) (1888, Waldeyer)
•
•
•
•
•
•
Kalıtımın fiziksel temeli kromozomlardır (1892,Weissmann)
Kalıtımın kromozomal teorisi ve kromozomların yapısını, fonksiyonlarını ve hastalık
ilişkisini araştıran bilim dalı “sitogenetik” (1902, Sutton)
Erkekler 47, dişiler 48 kromozom (1912, von Winiwarter)
Kromozom sayısı 48 (1923, Painter)
Kromozomlar boyandı (1924, Feulgen)
Kolşisin (1932, Blakeslee ve Eigsti)
Hipotonik solusyon kullanıldı (1953),
Kolşisin+hipotonik şok kullanıldı (1955, Ford ve Hamerton)
•
•
•
•
Down sendromu (1959, Lejeune)
Ph kromozomu (1960, Nowell)
“cat cry, 5p-” (1963, Lejeune)
QFA (1968, Caspersson )
•
•
•
•
•
•
•
•
İnsanda 2n=46 (1956, Tijo ve Levan) “Modern sitogenetiğin başlaması”
G band (1970, Drets veShaw )
ISCN (International System for Human Cytogenetic Nomenclature,1971)
HRBT (Prometafaz, High Resolution Banding Technique, 1981)
ISH (1981)
FISH (1990, Lichter)
G Bantlama (GTG)
Metafaz plağı
Prometafaz plağı
GTG- Karyotip
HRBT karyotip
Metafaz
450
Prometafaz(HRBT)
500
600
bant/haploid set
700
~ 500 bant çözünürlükte
~ 1 bant 6 milyon nükleotid
(~6 Mb ve 10’larca gen)
Fluoresan In Situ Hibridizasyon
(FISH)
Fluorescence
in situ hybridization
(FISH)
Need to suspect a
specific diagnosis!
Spektral karyotipleme
Kromozom
Kromozom
Kromozom
Kromozom
Kromozom
21
13
18
X
Y
~500 bant düzeyinde “Karyotipleme”
•Tek test
tüm genom/kromozomlar
•Tüm sayısal anomaliler;
69,XXX
47,XY,+13 .nuc ish(RB1x3)
45,X .nuc ish(DXZ1x1)
47,XX,+ 21.nuc ish(D21S65x3)
~500 bant düzeyinde “Karyotipleme”
Yapısal kromozom anomalilerinin araştırılmasında sitogenetik yaklaşım
46,XX,5p-
Bant paternine göre
Karyotip;46,XX,5p•Sadece delesyon ?
•Derivatif kromozom ?
Parental kromozom analizleri;
Anne ve Baba “Normal”
46,XX,del(5)(p15.1->pter) dn
FISH ile kırık noktalarının belirlenmesi ve konfirmasyon;
46,XX,del(5)(p15.1->pter).ishdel(5)(p15.1->pter)(CTNND2-)
Yorum; Olgudaki 5p15.1->pter bölgesi için parsiyel
monozominin fenotipi etkilemesi beklenmektedir.
~500 bant düzeyinde “Karyotipleme”
Fetus 46,XY,3p+,der(3)t(3;20)(p25.3;p11.2) mat
,der(3)(20pter->20p11.2::3p25.3->3qter)mat
Anne 46,XX,t(3;20)(p25.3;p11.2)
Yorum; Fetus, annedeki translokasyonun Adjacent-1 dağılımı ürünü derivatif 3
kromozomunu taşıdığından 20pter->p11.2 bölgesi için trizomik ve 3p25.3->pter
bölgesi için monozomiktir ve fenotipik olarak etkilenmesi beklenmektedir.
Kompleks Kromozom
Anomalilerinin
Aydınlatılması
46,XY,t(2q;8q;13q)?
2pq wcp
2pq subtel
46,XY,t(8;13)(q24.13;q21.2).ish ins(2)(p16.2q33.2q22.2)(wcp2, wcp8, wcp13, 2pqsubtel).ish
ins(2)(pter->p16.2::q33.2->q22.2::p16.2->q33.2->qter)dn Karaman et al. 2009
Yorum;Mikroskobik olarak dengeli görünen bu de novo kompleks kromozom anomalisinin
fenotip üzerine etkisinin a-CGH tekniği ile araştırılması gerekmektedir.
~500 bant düzeyinde “Karyotipleme”
• Klinik yönlendirme varsa bilinen mikrodelesyon sendromları (~ 3-5Mb)
A
A. 46,--,del(22)(q11.2) . ishdel(22)(q11.2q11.2)(D22S75-)
Yorum; Olguda saptanan 22q11.2 bandındaki delesyonun fenotipi etkilemesi
beklenmektedir. Bu delesyon DGS/VCFS ile uyumludur.
B. 46,--(D22S75x2)
Yorum; FISH incelemesinde D22S75 probu ile delesyon saptanmamıştır.
B
Marker kromozom: Çoğunlukla normal kromozom setine ilave,
rutin bantlama teknikleri ile tanınamayan kromozomlar
D15Z4
47,XY,+mar
SNRPN
47,XY,+mar
47,XY,+idic(15)(q12)(D15Z4++,SNRPN++)
Yorum; 15. kromozom kökenli, izodisentrik ilave kromozom, olguda 15p->15q12 için
tetrazomiye yol açmaktadır ve fenotipi etkilemesi beklenmektedir.
Marker kromozomların yarısı fenotipi etkilemeyen ökromatin taşımayan
kromozomlar olduğundan kromozomal kökeninin ve içeriğinin belirlenmesi
gerekir (FISH veya a-CGH) !!!!
Kromozomal Polimorfizmler
1, 9, 16 ve Y ve tüm akrosentrik kromozomlarda sentromer, satellit
bölgelerinde görülen uzama, duplikasyon, inversiyon, kısalma gibi özellikler
“polimorfik bulgu” olarak tanımlanır ve toplumda yaygındır, sorun yaratmaz. Örn;
inv9, Yqh++, 13ps++
Ender görülen heterokromatin bölge değişiklikleri ise yanlış tanıya
götürebilir. Bu nedenle değişimin fenotip üzerine etkisi diğer tekniklerle
araştırılmalı ve doğru tanıya gidilmelidir.
Polimorfizm ya da yapısal anomali??
46,--,22ps++
Yorum; polimorfik bir özellik ve fenotipi
etkilemesi beklenmemektedir
46,--,22p+. ishdup(22)(q11.1->q13.1)
(wcp22, N25x2)
Yorum; duplikasyon 22q11.1->q13.1,
Fenotipi etkilenmesi beklenmektedir.
Mozaisizm
Tanım: Bir organizmada aynı bir zigottan kaynaklanan farklı genetik yapıda
hücrelerin bulunmasıdır.
• Mozaisizm, kromozom anomalileri ya da tek gen mutasyonları için olabilir.
• Bir doku ile de sınırlı kalabilir.
Fetal Kromozom Analizlerinde Karşılaşılan Mozaisizmler ve Sınıflandırması:
1. Psödomozaisizm (yalancı): Fetusta bulunmayan
a. Tek kapta/klonda “Tek hücre mozaisizmi (SCM)”- 1. düzey
b. Tek kapta “Çok hücre mozaisizmi (MCM)”- 2. düzey
2. >2 kap/klonda “Gerçek mozaisizm” - 3. düzey
Aynı bir kromozom anomalisinin;
•
farklı kültür kaplarında (“flask tekniği)
•
ya da farklı preparatlarda (in situ tekniği)
>2 metafazda (monozomilerde >3 metafazda)
saptanması ile “gerçek mozaisizm” tanısı konur.
mos 45,X [25]/47,XXX [25]/46,XX [15] Mozaik Turner sendromu
mos 46,XY [25]/47,XY,+21 [25 ] Mozaik Down sendromu
Fetal karyotip analizlerinde mozaisizm saptanırsa??
Kadın-Doğum uzmanları ne bilmek ister?
• Fetus normal ? anormal ?
• Kötü gebelik prognozu için risk artmış mı?
Kadın-Doğum uzmanları ne duymak istemezler?
• Yeni girişimler, ilave incelemeler, vs..
Örnek Olgu
Rapordaki Bilgiler; İsim, materyalin cinsi (amniyon mayii), tarih ve
“Amniyon sıvısı kültürlerinden elde metafaz plaklarının GTG bant tekniği
ile yapılan mikroskobik değerlendirmesinde;
50 metafaz plağında; 38 plakta 46,XY
9 plakta 47,XXY
3 plakta 47,XY,+21
1 plakta 48,XXY,+21 kromozom kuruluşu
gözlenmiştir. Gözlenen çoklu mozaik yapı nedeniyle fetusun kromozom
kuruluşunun belirlenebilmesi için kord kanının değerlendirilmesi
gereklidir.”
En önemli bilgi bu anomaliler kaç kültür kabında gözlendi??
Amniosentez tekrarlandı ve sonuç;
• fetus gerçek mozaik Klinefelter idi,
• trizomi 21’ li hücreler ise görülmedi ve aile gebeliğe devam kararı aldı.
İleri anne yaşı ve patolojik USG
nedeniyle uygulanan CVS de
Direkt Preparasyon
1. 46,XX,5p+
2. 46,XX,5p+.ish
idic(5)(p13.3)(wcp5pq++subtel5p-,5q++)
Hücre Kültürü; 46,XX,del(5)(p13.3->pter)(subtel5p-)
Fetal karyotip; mos 46,XX,idic(5)(p13.3)/46,XX,del(5)(p13.3->pter)(subtel5p-)
Yorum; Fetus 5p13.3->pter için monozomi ve 5p13.3->5qter için trizomi taşımaktadır.
Mozaisizmin dokulara dağılımı kesin olarak belirlenemez.
Fetusun fenotipinin etkilenmesi beklenmektedir.
Moleküler Karyotipleme
Olgu
Cy5
Kontrol
Cy3
KARYOTİPLEME vs ARRAY
Wapner R, ISCA (International Standarts for Cytogenomic Arrays)
2012 Mikroarray Çalışma Sonuçları;
•
4391 olgudan 51 olguda array sonuçsuz, başarı %98,8
•
4282 nonmozaik karyotip ve 58 mozaik karyotip
Anomaliler
Anöploidiler (tri
21,18,13,X,Y ve 45,X)
Dengesiz yapısal
Marker kromozom
Dengeli yapısal
Triploidi
Toplam
Kromozom n
Array
tanıyabilir
Array
tanıyamaz
374
374
0
22
22
0
3
2
40
0
17
456
0
398 (%87.3)
1
(heterokromatin)
40
17
(7 si SNP array ile
tanınabilirdi)
58 (%12.7)
Wapner R, ISCA (International Standarts for Cytogenomic Arrays)
2012 Mikroarray Çalışma Sonuçları;
Normal karyotip saptanan prenatal olgu n:3822
1) Klinik anlamı bilinmeyen CNVs n: 94 (%2.5)
Rapor edilmeyen CNVs n: 33 (%0.9)
Rapor edilen CNVs n: 61 (%1.6)
2) Patolojik CNVs
Klinik ile ilişkili CNVs
%2.5
n: 35 (%0.9)
Endikasyon gruplarına göre klinik ile ilişkili CNVs
İleri anne yaşı
n: 1966
n:34
%1.7
Positiv Tarama Testi
n:729
n:12
%1.6
Patolojik USG
n:755
n:45
%6
Karyotipi “Normal” prenatal olgularda array sonuçları;
Schaffer LG, et al, 2012;Prenat Diagn, 32, 979-985
Endikasyon
Pat-USG
Pat-USG (soft
markers)
MS-ST
Aile öyküsü
İleri Anne Yaşı
Psikolojik
Diğer/?
Toplam (canlı
fetuslar
Array-normal
Array-şüpheli
Array-patolojik
Toplam olgu
2462 (%88.5)
135 (%4.9)
184 (%6.6)
2781
72 (93.5)
3 (%3.9)
2 (%2.6)
77
68 (%88.3)
5 (%6.5)
4 (%5.2)
77
461 (%94.7)
11 (%2.3)
15 (%3.1)
487
337 (%97.4)
8 (%2.3)
1 (%0.3)
346
94 (%98.9)
1 (%1.1)
0
95
12 (%92.3)
0
1 (%7.7)
13
3506 (%90.5)
163 (%4.2)
207 (%5.3)
3876
Olgu KS 112
Karyotip endikasyonu; PATUSG (ventrikulomegali, CCA, ikiz eşi)
Karyotip; 47,XX,+mar
a-CGH endikasyonu; marker kromozomun aydınlatılması
47,XX,+mar . arr 9p24.3-q21.11 (0-71,226,556)x4/ 9p24.3-p23(0-10,016,576)x6
Konfirmasyon; FISH
wcp 9 arm spesifik
9 p ve q subtelomerik prob
47,XX,+mar1/48,XX,+mar1,+mar2 [56/4]. ish 47,XX,+i(9)(p?)/ 48,XX,+i(9)(p?),
+idic(9)(q21) 9ptel30(43N6x6, wcp9p++/wcp9q+, D9Z3++)[56/4]
. arr 9p24.3-q21.11 (0-71,226,556)x4/ 9p24.3-p23(0-10,016,576)x6
Yorum;
Olguda saptanan 2 marker kromozom da 9. kromozom kökenlidir.
Olgu 9p24.3->q21.11 bölgesi için tetrazomi ve
9p24.3->p23 bölgesi için hekzazomi taşımaktadır.
Bu anomalinin fenotipi etkilemesi beklenmektedir.
Olgu GD
Prenatal tanı endikasyonu; İleri anne yaşı+2’li testte artmış risk+ICSI (donuk embriodan)
CVS Karyotipi 13.GH; 46,--,t(2;4)(p23;q31.1)dn
a-CGH endikasyonu; görünürde dengeli de novo resiprokal translokasyon
a-CGH sonucu normal
22. GH, 2. düzey USG; Ense plisi kalınlığında artış
PTPN11 dizi analizi; 13. ekzonda heterozigot c.1529A>C de novo
(Leopard sendromu’nda tanımlanmış bir mutasyon)
Kromozom Anomalierinin Tanısında
Kullanılan Teknikler
Tüm genomu inceler
Dengeli kromozom anomalilerini
tanır
Düşük oranlı mozaikler saptanır
3n/4n tanısı mümkün
Lokusa /kromozoma özeldir
Rezolüsyonu yüksektir <3Mb)
Otomatizasyona uygundur
3n/4n tanısı mümkün
Tüm genomu inceler
Rezolüsyonu en yüksek (>100 Kb)
Hücre kültürü gerekmez
Otomatizasyona uygundur
Rezolüsyon daha düşüktür (510 Mb)
Hücre kültürü gerektirir
Tanı subjektiftir
Otomatizasyon zordur
Endikasyona göre hücre
kültürü gerekir
Endikasyona göre kullanılır
Dengeli kromozomal değişimleri
tanıyamaz
Düşük oranlı (<%10) mozaikleri
tanıyamaz
Bioinformatik çalışma gerektirir
Henüz pahalı
ACOG (2009; Obstet and Gynecol, 114:5,1161-1163)
SIGU çalışma grubu (2012;Ultrasound Obstet Gynecol, 39:384-388)
1) konvensiyonel karyotipin yerini almaması gerektiği,
2) tüm gebeliklerde genel tarama için değil seçilmiş gebeliklerde özel tanı amacıyla
kullanılması gerektiğini,
3) prenatal tanıda özel endikasyonlarda;
i)
izole veya multiple USG anomalisi saptanan gebelikler
ii) karyotip analizinde dengeli bile görünse de novo yapısal kromozom anomalilerinde
iii) marker kromozomların karakterizasyonunda tamamlayıcı ikinci bir test olarak
kullanılmasını önermektedir
4) “hedefe yönelik array” testi öncesinde ve sonrasında verilecek danışmalarla, anne
babalar a-CGH in tüm patolojileri yakalayamayabileceği ve a-CGH sonuçlarının
yorumunun zor olabileceği konusunda bilgilendirilmeli
5) Array faydalı bir test olmakla birlikte, ilave çalışmalar (parental testler,
konfirmasyonlar) gerekebilir ve maliyet artar
ı