Transcript FFMBG103- MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİK 1

1
FFMBG103MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE
GENETİK 1
08 Nisan 2015
Çarşamba
Nükleik Asitler
Gen-Genetik Kod-Genetik bilgi
2
Kromozom
Nukleus
Kromozom
Gen
Gen
08 Nisan 2015 Çarşamba
1. Genetik materyalin dört özelliği:
3




Replikasyon-kendini eşleyebilmesi
Bilgi depolama
Bilgiyi ifade etme
Mutasyonlarla varyasyon gösterme
mRNA
Protein
rRNA
Translasyon
tRNA
Ribozom
Transkripsiyon
Replikasyon
DNA
Sentral doğma
08 Nisan 2015 Çarşamba
2. Genetik materyal Protein mi?
Nükleik asit mi?
4
Fried Miescher (1868):

Lökosit çekirdeği-somon
balığı sperm hücrelerinüklein: asidik

DNA+bazik
P
proteinler;Fosfor ;Sülfür
“Nüklein’in hücre kalıtımı
ile ilgili olabileceği fikri”

Phoebus A. Levene
(1910): tetranukleotit
hipotezi
1:1:1:1 oranı
Şeker
P
A
Şeker
A
P
Şeker
P
A
Şeker
08 Nisan 2015 Çarşamba
A
3. Genetik Materyal: DNA’nın keşfi5
Fred Griffith (1927-8)

– İlk transformasyon deneyleri Diplococcus
(Streptococcus) pneumoniae
Isı ile öldürülmüşS hücreleri
ve canlı R hücrelerii karışımı
CanlıS hücreleri
(kontrol) virülent
Canlı R hücreleri
(kontrol) avirülent
Isı ile öldürülmüş
S hücreleri
“Transformasyon
sebebi ilke”
Kalıtımı kontrol eden
bir molekül mevcuttur
SONUÇLAR
Fare ölür
Fare sağlıklı
Fare sağlıklı
Mouse ölür
Kan örneklerinde
canlı S hücreleri
bulundu
08 Nisan 2015 Çarşamba
DNA’nın keşfi-Oswald T. Avery,
Macleod, McCarty (1944)
6

Transformasyon
sebebi ilkeGriffith’in
sonuçlarından
sorumlu olan
genetik materyal
DNA olduğu
kanıtlandı.
RNaz
ilavesi
S suşuna ait filtrat (DNA ve RNA
protein karışımı)
R bakterilerine
DNA’nın eklenmesi
Sadece DNA ve
protein kalır
DNaz
ilavesi
S suşuna ait filtrat
R bakterilerine
RNA’nın eklenmesi
SadeceRNA ve
protein kalır
Proteaz
ilavesi
S suşuna ait filtrat
R bakterilerine
DNA-RNA’nın
eklenmesi
DNA-RNA kalır
kalır
Besiyerine
ekim yapılır
S transformantı ürer
R hücreleri ürer
Besiyerine
ekim yapılır
S transformantı üremez
Sadece R ürer
Besiyerine
ekim yapılır
08 Nisan 2015 Çarşamba
S transformantı ürer
R hücresi ürer
DNA’nın keşfi-Virülent T2 fajının yaşam
döngüsü)
LİTİK DÖNGÜ
7
Bakteri hücre
duvarının
Enzimlerle
parçalanmasıyla
yeni nesil fajların
dışarı
çıkması
Fajın E. coli ye tutunması, ve
faj kromozomunu enjeksiyonu
Fajıa özgün enzimlerle
Bakteri kromozomunun
parçalanması
Faj
kromozomu
Bakteri (konak)
kromozomu
Konak E. coli hücresi
Faj
kromozomu
Bakteri kromozomu
tamamen parçalanır
Faj
kromozomları
Faj kafasının
oluşması
Progeny faj
partiküllerinin
biraraya
getirilmesi
Faj
parçaları
Fajın yapısal içeriğinin
üretilmesi için faj
genlerinin ekspresyonu
Bakteri materyallerinin
Ve faj enzimlerinin
kullanılarak
faj kromozomunun
replikasyonu
08 Nisan 2015 Çarşamba
DNA’nın keşfi- Hershey-Chase Deneyleri
(1952)
8
 Yeni faj partiküllerinin sentezlenebilmesi için gerekli bilgiyi taşıyan ve bakteri
hücresine aktarılan molekül DNA
P32
S35
DNA
Protein kılıf
(metiyonin sistein)
Faj
Radioaktif
protein
Boş
protein kılıf
Sıvıda Radyoaktivite,
(faj proteini)
Bacterial cell
1:
Sulfur (35S)
DNA
Faj
DNA
Santrifüj
Pellet (bakteri
hücreleri ve içerikleri)
Radyoaktif
DNA
2:
Fosfor (32P)
Santrifüj
Pellet
Radyoaktivite
(faj DNA)
in pellet
08 Nisan 2015 Çarşamba


DNA’nın Dağılımı
Mutajenez
Doğrudan Kanıtlar:
Rekombinant DNA
çalışmaları
Mutasyon frekansı
Dolaylı Kanıtlar:
Aksiyon spektrumu
Nükleik asitler
240 250 260 270 280 290
Absorpsiyon spektrumu
UV
dalgaboyu
(λ)

Absorpsiyon
9
4. DNA nın ökaryotlardaki genetik
materyal olduğunun kanıtları
Protein
240 250 260 270 280 290
UV
dalgaboyu
(λ)
08 Nisan 2015 Çarşamba
10
5. Bazı virüslerde RNA’nın genetik
materyal olarak işlevi




Bazı virüsler DNA değil RNA içerirler.
Tütün mozaik virüsü 1956, tütün yapraklarında viral
enfeksiyon
Hibrit virüsler (TMV+Holmes ribgrass[HR])
RNA replikaz, 1965-1966
faj Q RNA sı izole edildi ve in vitro da replike edildi, enzim enfekte olan E. coli’den izole
edildi, test tüpünde sentezlenen RNA E. coli yi enfekte edip normal faj elde edildi

Retrovirüsler:
Konak hücreyi enfeksiyonu takiben RNA sı nı kalıp olarak kullanarak komplementer DNA
molekülünün sentezini yönetir.
Revers transkripsiyon: revers transkriptaz enzimi ( RNA ya bağımlı DNA polimeraz enzimi)
Oluşan DNA konak hücrenin DNA sına girer, konak DNA transkrip olurken retroviral romozom
da çoğalır . Örnek AIDS etmeni HIV virüsü, RNA tümör virüsleri
08 Nisan 2015 Çarşamba
6. Nükleik asit Kimyası
11

Nükleotitler: Nükleik asitlerin yapı taşları
Fosfat
Pürin ya da
pirimidin
bazı
Pentoz
= Nitrojen Baz + Pentoz Şeker + Fosfat grup
Pürinler (9 üyeli çift halkalı)– Adenin &Guanin
Pirimidinler (6 üyeli tek halkalı–Timin&Sitozin&Urasil
08 Nisan 2015 Çarşamba
Nükleik asitlerin bileşenleri
(Nitrojen bazları-azotlu bazlar)
12
Adenin (A)
Pürinler
Pürin
Pirimidin
Guanin (G)
Timin (T)
(DNA)
Sitozin (C) Urasil (U)
(DNA, RNA) (RNA)
Pirimidinler
DNA
08 Nisan 2015 Çarşamba
RNA
Nükleik asitlerin bileşenleri
(Pentoz şekerler)
13



Ribonükleotitlerde 2’-OH RNA da bulunur
Deoxyribonükleotitlerde a 2’-H DNA da bulunur
Şekerler azot bazlardan ayırtedilebilmeleri için
numaralandırılmış karbon atomları içerirler
Bu karbonda
oksijen atomu
bulunmaz
Riboz
Deoksiriboz08 Nisan 2015 Çarşamba
Nükleik asit Kimyası
14



Nükleozitler = Baz + Şeker
NMP = nükleozit + 1 PO4
NDP = nükleozit +2 PO4
Nükleozit
Nükleotit
NTP = nükleozit + 3 PO4
Nükleik asitlerin yapı taşıdır
özel NTPs: ATP & GTP

Nükleozitlerin isimlendirilmeleri ve genel yapıları
08 Nisan 2015 Çarşamba
Nükleozit ve Nükleotit isimlendirilmeleri
Baz
Nükleozitler
Nükleotitler
Nükleik asit oluşumundaki bağlar
16





Şekerin C-1’ atomu nitrojen
bazla kimyasal bağ yapar
Pürin bazı şekerin N-9
atomuna kovalent bağ
yapar
Pirimidin bazı şekerin N-1
atomuna kovalent bağ
yapar
Nukleotitler şekerin C-2’, C3’ ve C-5’ atomlarına
bağlanabilirler
Ancak, C-5’ konfigürasyonu
biyolojik sistemlerdeki en
yaygın olan, DNA ve RNA
da bulunan mevcut formdur.
08 Nisan 2015 Çarşamba
Nükleozit Difosfatlar ve trifosfatlar,
AMP, ADP ve ATP


Ek fosfat grupları nüklozit 5’- monofosfatlara eklenebilir ve difosfatlar and
trifosfatlar oluşur
ATP hücre aktiviteleri için en önemli enerji kaynağıdır
5’-monofosfat
Adenozin 5’-monofosfat (AMP)
5’-difosfat
Adenozin 5’-difosfat (ADP)
Adenozin 5’-trifosfat (ATP)
Polinükleotitler
18





İki mononükletit arasında bağ
yapısında, iki şekere bağlı fosfat
grubu
yer
alır
oluşan
bağ
fosfodiester bağıdır, çünkü fosforik
asit her iki taraftaki alkol grubu ( iki
şekerdeki OH grubu ) ile ester bağı
yapar. Aynı bağ, RNA da da bulunur.
dinukleotitler & trinükleotitler
oligonükleotitler (<20)
polinükleotitler (>20)
Uzun polinükleotid zincirleri
varyasyon sağlamaktadır.
 1000 nt oluşan bir zincir 41000
kombinasyon ile oluşturulabilir.
 Levene’nin tetranükleotid hipotezi
bu varyasyonu sağlamamaktadır.
08 Nisan 2015 Çarşamba
Fosfodiester bağları
Şeker-fosfat iskeleti
BAZlar
5’ uç
5'
19
1'
4'
2'
3'
DNA’nın kovalent iskeleti
5'
Fosfodiester
bağları
1'
4'
2'
3'
5'
1'
4'
2'
3'
3’ uç
5'
1'
4'
Fosfat
2'
3'
Şeker (deoksiriboz)
08 Nisan 2015 Çarşamba
DNA
nükleotid
7. DNA Modeli: James D. Watson &
Francis H. Crick
20


DNA’nın double helix modelinin sunulması
Bilginin esas iki kaynağı:


1. Hidrolize olmuş DNA örneğinin baz kompozisyon analizi “Chargaff
Kuralı”: #A#T and #G#C. “A strange but possibly meaningless
phenomenon”.
2. X-ray kırınım çalışmaları: Rosalind Franklin & Maurice H. F. Wilkins
08 Nisan 2015 Çarşamba
Chargaff Kuralları (Erwin Chargaff
1949-1953)
21








DNA’nın baz içeriği bir türden diğerine değişiklik göstermektedir
DNA’nın baz içeriği bir türün farklı bireylerinde ya da bireyin farklı dokularında
değişiklik göstermez
DNA’nın baz içeriği zamanla değişmez
DNA’nın baz içeriği beslenme, yaş, çevre faktörler vb. nedeniyle değişmez,
Herhangi bir türe ait DNA nın nükleotidlerine parçalandığında serbest kalan
nukleotidlerde Adenin (A) moleküllerinin sayısı timin (T) molekülleri sayısına,
guanin (G) moleküllerinin sayısı sitozin (C) moleküllerinin sayısına eşittir

%A = %T ve %G = %C

(A/T=1 ve G/C=1)

Pürin sayısı=pirimidin sayısı

(A+G)=(T+C)
GC oranı türler arasında farklılık göstermekte ve bu oran organizmaya bağlı olarak
%22-%76 arasında değişmektedir.–
% G+C oranının %A+T oranına eşit olması gerekmez
İşte Watson ve Crick bu bulguları değerlendirerek 08
böyle
özelliklere sahip
Nisan 2015 Çarşamba
DNA makro molekülünün sekonder yapısına ait bir model geliştirdiler.
X-ışını kırınım Analizi
22


DNA zincirleri X-ışını bombardımanına
tutulur ve molekülün atomik yapısına
göre saçtığı ışınlar belirlenir. Buna
göre;
1947- William Astbury DNA’da 3.4 A
aralıklarla
tekrarlayan
yapıların
varlığını doğrulamış ve DNA’nın bir
çeşit sarmal yapıda olduğunu ileri
sürmüştür.
1950-1953- Rosalind Franklin
3.4 A aralıklarla tekrarlayan yapıların
varlığını doğrulamış (William Astbury
tarafından önerilen) ve DNA’nın bir
çeşit sarmal yapıda olduğunu daha
saf örnekler kullanara gösterebilmiştir.
1 nm=10 A0

08 Nisan 2015 Çarşamba
DNA sarmalı
Watson-Crick
Modeli
Çap 20
Baz, şeker ve fosfat durumu, Hbağları
Ao
5’
3’
23







İki uzun polinükleotit zinciri bir merkez
eksen etrafında kıvrılarak, sağ-el ikili
sarmal yapısını oluşturur
İki zincir birbirine antiparaleldir; iki
zincirin C-5’ ucundan C-3’ ucuna doğru
olan yönleri birbirine göre terstir.
Her iki zincirin bazları düzlemsel yapıda
olup düzlemlere eksene diktir. Bazlar
arasındaki mesafe 3.4 A olup birbiri
üzerine istiflenmiş durumdadırlar ve
sarmal içerisinde yer alırlar.
Karşı zincirdeki azotlu bazlar hidrojen
bağları ile birbirileri ile eşleşirler.
DNA’da sadece A=T ve G C
eşleşmesi olabilir (komplementerlik).
Sarmalın her bir tam dönüşü 34 A (3.4
nm) dir. Her bir zincirde bir dönüşte 10
baz yer alır.
Molekülün herhangi bir bölümünde, eksen
boyunca sıra ile daha geniş olan büyük
(majör) oluklar ve daha dar olan (küçük)
minör) oluklar görülmektedir.
Sarmal 20 A (2 nm) çapındadır.
Küçük oluk
Bir tam dönüş
34 Ao
şeker-fosfat
iskeleti
3’
5’
Büyük
oluk
Bazların yatay istiflenmesi
Baz çifti
3.4 Ao
08 Nisan 2015 Çarşamba
Merkezi eksen
DNA sarmalı
24
08 Nisan 2015 Çarşamba
DNA sarmalı
25
DNA’daki
baz
eşleşmesi
modelin genetik açıdan en
önemli özelliğidir. Bu yerleşim
nedeniyle eksen boyunca
büyük ve küçük oluklar ortaya
çıkar.

Sağ el sarmalının uzaydaki
konformasyonu, Watson Crick’in
verilerine en uygun olanıdır.
08 Nisan 2015 Çarşamba
1962: Fizyoloji ve Medicine Nobel Ödülü
Watson, J.D. and F.H. Crick, “Molecular Structure of Nucleic Acids: A Structure for
Deoxynucleic Acids”. Nature 171 (1953), p. 738.
James D.
Watson
Francis H.
Crick
Maurice H. F.
Wilkins
Peki ?
Rosalind Franklin
26
08 Nisan 2015 Çarşamba
DNA’nın formları
27


Tek-kristal-X-ışını analizi çalışmaları ile 5 A’luk
çözünürlük 1 A’a kadar düşürülmüştür.
A-DNA right handed (11 baz/ 1 tam dönüş/çap 23 Å)—yüksek tuz kons. Yada dehidrasyon
koşullarında baskındır.

B-DNA right handed (normal, 10 baz/dönüş, çap 20 Å)

C-DNA right handed (dehydrated, 9.3 baz/dönüş,19Å)

D-DNA right handed (no guanine, 8 baz/dönüş)

E-DNA right handed (no guanine, 7.5 baz/dönüş)

Z-DNA left handed (hepsi GC, 12 baz/dönüş, 18 Å) (1979) Büyük oluk neredeyse yok denilebilir

P-DNA DNA yapay şekilde uzatılırsa bu formu alır, fosfat grupları iç kısımda azotlu bazlar
sarmalın dış yüzünde

why should we care?

Fizyolojik koşullarda rasgele bir DNA dizesinde en stabil form B formudur.

A formu su dışında birçok çözeltide oluşan bir formdur.

Z formu: sola doğru dönen heliks yapısındadır. Z formu bazı genlerin ekspresyonlarının
08 Nisan 2015 Çarşamba
regulasyonunda rol alabilir.
DNA’nın formları
28
Sarmal
Tipi
Dönüşbaşına Baz çifti
baz çifti
baına dönüş
Sarmal
çapı
A
11
+34.7O
23 AO
B
10
+34.0O
19 AO
Z
12
-30.0O
18 AO
08 Nisan 2015 Çarşamba
9. RNA yapısı
29






Çift yada tek zincirli
olabilir
A’da T yerine U bulunur
mRNA, rRNA, tRNA
snRNA (RNA
processing)
Telomeraz RNA
(replikasyon)
antisense RNA
(regülasyon)
08 Nisan 2015 Çarşamba
10. DNA ve RNA Araştırmalarında Kullanılan
Analitik Yöntemler
30


U.V ışığının soğurulması
(254-260 nm arasında en
fazla)
Çökelme Davranışı- Nükleik
asitler çeşitli gradiyent
santrifügasyon işlemleri ile
ayrılabilirler.
Çökelme
özelliği
molekülün
yoğunluğu,
kütlesi
ve
biçimine
bağlıdır
ve
Svedberg katsayısı (S)
olarak ölçülür.
08 Nisan 2015 Çarşamba
31
Nükleik asitlerin denatürasyonu ve
renatürasyonu
08 Nisan 2015 Çarşamba
32
08 Nisan 2015 Çarşamba
Moleküler hibridizasyon
33
08 Nisan 2015 Çarşamba
C0t eğrisi ve genom büyüklükleri
34
1
Tek zincirli kalma fraksiyonu
(C/C0)
Genom büyüklükleri
E. coli> T4>MS2
E. coli
MS2
0.5
C0: Başlangıç DNA
konsantrasyonu
t: inkübasyon zamanı
C: renatüre olmamış DNA
Konsantrasyonu
k: İkinci dereceden tekrar
birleşme sabiti
T4
0
10-4
10 -3 10-2
10-1 1
10
102 103 104
C/C0= 1/1+k C0t
C0t (molxsn/l)
C0t1/2
08 Nisan 2015 Çarşamba
105
Semender
C0t1/2)
104
Tek zincirli kalma
fraksiyonu (C/C0)
35
Reasosiasyon kinetiği ve tekrarlı
DNA
Calf
103
102
10
E.coli
T4
1
106
10
7
108
109
1010
1011
Nukleotit çiftlerindeki
Genom büyüklüğü(komplekslik-X)
1012
1
E. coli
0.5
0
Calf thymus
tekrarlı DNA
Calf thymus
özgül DNA
10-4 10-3 10-2 10-1 1 10-10 1 102 103 104
C0t (molxsn/l)
08 Nisan 2015 Çarşamba
DNA daki özel baz dizileri



Palindrom – Ters tekrarlar
Ayna tekrarlar
Hairpin (Saç tokası) ve Cruciform (Haç şekli) Yapılar
Büyük DNA moleküller hücre
içerisinde super coiller oluşturarak
bulunurlar
Relaks, gevşek
supercoiled
Çıkarımlar..
38






Bazı virüsler haricinde DNA dünyadaki tüm yaşayan
organizmaların genetik materyalidir
Watson-Crick modeline göre; DNA right handed-double
heliks formunda bulunur
Double heliksin zincirleri komplementer nitrojen bazları
arasındaki hidrojen bağı ile birarada tutulurlar
DNA yapısı genetik bilginin saklanmasını ve ifade
edilmesini sağlar
RNA DNA’ya benzer özellikler taşır, ancak farklı olarak
tek-zincirli bir molekül olarak bulunmaktadır
Bazı virüslerde, RNA genetik materyaldir
08 Nisan 2015 Çarşamba