Transcript Gene cloning

1
Gene Engineering
การสร้ าง gene ใหม่
 โดยตัดต่ อระหว่ าง DNA จากแหล่ งทีต
่ ่ างกัน


ได้ DNA โมเลกุลใหม่ เป็ นโมเลกุลผสม เรียกว่ า
Recombinant DNA

วิธีการทาหรือ methodology เรียกว่ า
Recombinant DNA technology หรือ
Genetic engineering หรือ Gene cloning
2
I. หลักการ Recombinant DNA (Gene cloning)
 II. ส่ วนประกอบในการทา gene cloning
 III. การประยุกต์ ใช้ Gene cloning

3
I. หลักการทา Recombinant DNA
1. แยก DNA ของพาหะ และ DNA ทีต่ ้ องการทา
cloning
2. ตัด DNA ของทั้ง 2 แหล่ งด้ วย Restriction
endonuclease
3. ผสม DNA ทั้ง 2 แหล่ ง กับ DNA ligase ภายใต้
เงือ่ นใขให้ DNAs ต่ อกัน --> ได้ Recombinant DNA
หรือ Chimeric DNA
4
การสร้ าง Recombinant DNA
5
II. ส่ วนประกอบของการทา Gene Cloning
1. Gene ทีต่ ้ องการศึกษา เรียกว่ า foreign DNA
2. DNA พาหะ เรียว่ า Vector DNA
3. Restriction endonuclease
4. DNA ligase ต่ อระหว่ าง 2 nucleotides
5. Host cells สาหรับ recombinant DNA เพือ่ เพิม่
จานวนในขั้นต้ นของกระบวนการ
ทีพ่ ฒ
ั นาใช้ ได้ แล้ วมี bacteria บางชนิด และ yeast
6
ขั้นตอนละเอียดในการทา Gene cloning
1. เลือก DNA โมเลกุลทีต่ ้ องการ clone เรียกว่ า
Foreign DNA และเลือก DNA โมเลกุลทีน่ าหน้ าที่
เป็ นพาหะ เรียกว่ า Vector DNA
 ตัด foreign DNA และ ตัด vector DNA ด้ วย
enzyme ชนิดเดียวกัน Enzyme ทีใ่ ช้ เรียกว่ า
Restriction enzyme (แยกคนละหลอด)
7
2. เลือกท่ อน (fragment) ของ cut foreign DNA ขนาด
พอเหมาะทีจ่ ะ clone โดย


แยก DNA ในแผ่ นวุ้น ใน สนามไฟฟ้ า เรียกวิธีนีว้ ่ า
Electrophoresis ซึ่ง DNA จะถูกออกจากกันตามขนาด
ความยาว ได้ ปรากฏเป็ นแถบ (bands) ต่ าง ๆ กัน
ตัดและแยกแถบทีต่ ้ องการออกมาสกัดแยก DNA ท่ อน
(fragment) ทีต่ ้ องการ
8
DNA gel
electrophoresis
สาหรับแยก
ชิ้นส่ วน DNA
9
3. Insert DNA fragment เข้ าไปในโมเลกุลของ cut vector
DNA ด้ วย enzyme Ligase จะได้ DNA ผสมโมเลกุล
ใหม่ เรียกว่ า Chimeric DNA หรือ Recombinant DNA
4. นา Recombinant DNA เข้ าไปใน host cells ของ
cloning vector โดยวิธี Transformation หรือ วิธีอนื่ ๆ
host cells โดยทัว่ ไปใช้ E. coli และ yeast
5. Recombinant DNA ภายใน host จะแบ่ งตัวเพิม่ จานวน
เรียกว่ า Amplification และถ่ ายทอดไปพร้ อมกับการ
แบ่ งตัวเพิม่ จานวนของ host ทาให้ ได้ identical copies
หรือ clones ของ recombinant DNA จานวนมาก
1
หลักการพืน้ ฐาน
ของ Gene cloning
 Clone หมายถึง
ประชากร (copy) ที่
เหมือนกันของ
สิ่ งมีชีวติ หรือ
โมเลกุล

1
6. ทาการตรวจเลือกหา (screening) host cells มี
recombinant DNA
1
Cloning Vectors
1. Plasmid
2. Bacteriophage
3. Cosmid
4. Phagemid
5. Artificial chromosome
1
1. Plasmid vectors
Plasmids
 เป็ น extrachromosome ใน microorganisms โดยเฉพาะ
bacteria
 เป็ น double-stranded circular โมเลกุล
 ขนาด ~ 1 kb (1 kb = 1000 bp) ถึง 200 kb
 มี antibiotic-resistant genes ทีส
่ ามารถใช้ เป็ น markers
สาหรับคัดเลือก clones ที่ positive
 pBR322 เป็ น plasmid ตัวแรกทีใ่ ช้ ใน cloning
1
1.1 Plasmid pBR322
ขนาด 4.3 Kb
 มี Ampicillin resisteant gene
Tetracyclin resistant gene
 มี restriction sites มากและ
ง่ ายต่ อการใช้ ทา cloning
เช่ น EcoRI, PstI, BamHI
 มี Origin of replication
 เป็ น cloning vector ใน prokaryote
 นาเข้ า bacteria โดย Transformation

1

Bacterial
cloning โดย
ใช้
plasmid
pBR322
1
1.2 Yeast episomal plasmids / YEps
ดัดแปลงจาก 2 um plasmid (พิเศษ) ของ yeast
 ขนาด 6 kb
 มี resistant gene ต่ อ inhibitors เช่ น copper และ
methotrexate
 marker คือ leu2 gene
 ใช้ เป็ น cloning vector ใน eukaryote
 Transform yeast

1

Yeast
cloning
โดยใช้
plasmid
ทีม่ ี LEU2
gene
เป็ น
marker
1
1.3 Ti plasmid
Ti plasmid หรือ T-DNA ใน Agrobacterium tumefaciens
ในดิน
 integrate เข้ า plant chromosomal DNA
 ทาให้ เกิดเนือ
้ งอกในพืช (callus) หรือ cancer growth หรือ
crown gall ในพืช

1
Gene cloning โดย
ใช้ Ti plasmid
 เพือ
่ ให้ T-DNA
(tumor DNA) ใน
bacteria infect
(แทรก) เข้ า
chromosome ของ
พืช --> crown gall
--> ชักนาให้ เจริญ
เป็ นต้ นพืช

2
2. Bacteriophage vectors
Double-stranded virus ทีบ่ างระยะของวงจรชีวติ อยู่ในรู ป
Linear duplex
 ส่ วนมากใช้ Bacteriophage Lambda (l) ขนาด ~ 50 kb
 l มี genes ~ 50 % อยู่ 2 ข้ างของ linear duplex ทีจ
่ าเป็ น
ต่ อ growth
 บริ เวณกลางไม่ จาเป็ นต่ อ growth สามารถตัดออกได้
 l package DNA ให้ เป็ น circular form ได้ 78-105 %

2


การใช้ phage l
cos
เป็ น cloning vector
cos
ส่ วนกลางเป็ นส่ วนที่
ไม่ จาเป็ นในการ
ดารงชีพของ phage
จึงสามารถเอา
foreign DNA ใส่ เข้ า
ไปแทนได้
2
ใน Linear duplex ทีบ่ ริเวณปลายสุ ดทั้ง 2 ข้ างของเส้ นเป็ น
ช่ วง Single strand ขนาด 12 nucleotides เรียกว่ า
Cohesive ends หรือ COS sites
 Cos sites ทา complementary ต่ อกัน ให้ ได้ circular
duplex DNA ก่ อน pack เข้ า capsule กลายเป็ น
bacteriophage ใหม่


l vector รับ insert ได้ 12-25 % จึงเหมาะสาหรับใน
การทา cloning ของ eukaryotic genes ซึ่งส่ วนมี
ขนาดใหญ่ เช่ น ใช้ ทา Genomic library
2
2.2 M13 vector
Single-stranded phage
 รั บ insert ทีเ่ ป็ น
single-stranded DNA
ระหว่ าง 300-1000 bases
 Rolling circle replication ให้ double strand
 ออกจาก bacteria ในรู ป single strand
 เหมาะสาหรั บใช้ cloning เพือ
่ sequence DNA

2
3. Cosmid vector
Vector ทีส่ ร้ าง (construct) จากส่ วนของ
1. Plasmid : drug-resistant marker, origin of replication
และ restriction sites จึงมี replication ได้ เหมือน
plasmid
2. Phage : cos sites สาหรับ packaging cloned DNA ให้
เป็ น phage chromosome ใน in vtro
2
cosmid มีขนาด 4-6 kb
 construct ให้ มี
polycloning site
 cosmid สามารถรั บ insert
foreign DNA ได้ ระหว่ าง
35 - 50 kb
 เหมาะในการ clone gene
ขนาดใหญ่ ของ eukaryote

2
4. Pagemid vector
Vector ที่ construct ให้ มี คุณลักษณะคล้ าย cosmid คือ มี
ทั้งลักษณะของ phage และ plasmid
 มี multiple cloning site insert เข้ าที่ lacZ gene
 มี origin of replication จาก single-stranded f1 คล้ าย
M13 ทาให้ package ได้ single-stranded phagemid DNA

2
Bluescript vector / pBS ใช้ เป็ น Transcription vector
 มี Multiple cloning site
 มี 2 promoters คือ
 T3 promoter ข้ างหนึ่ง และ
 T7 promoter อีกข้ างหนึ่ง
 สามารถ transcribe RNA ใน in vitro
 ใช้ ศึกษา translation in vitro

2
5. Artificial chromosome
เป็ น Construct เพีอ่ ทา cloning ใน yeast เรียกว่ า Yeast
Artificial chromosome / YAC
 เป็ น mini-chromosome ประกอบด้ วย
 1 centromere, 2 telomeres, origin of replication,
และ seletable marker gene(s)


ใช้ ศึกษา chromosome segregation ระหว่ าง meiosis
และ cloning DNA ขนาดใหญ่ ได้ ถึง 150 kb
2
Yeast Artificial chromosome / YAC
3
Restriction Endonuclease
recognize specific nucleotide sequences
 ตัดระหว่ าง 4-8 nucleotide ลาดับเฉพาะแต่ ละชนิด

3

Resstriction
enzymes
ตัด DNA ให้
ปลาย 2 แบบ
Blunt end
 Sticky end

3
DNA ligase
เชื่อมต่ อระหว่ าง
2 nucleotide ของ
2 DNA โมเลกุล
 Sticky ends :
efficiency ค่ อนข้ าง
ดี
 Blunt ends :
efficiency น้ อยกว่ า

3
3
DNA library
คือ ห้ องสมุด หรือ sets ของ cloned DNA ใน vectors ที่
เก็บไว้ ท้งั หมดใน host cells เพือ่ ใช้ ตรวจหาและศึกษา
genes ภายหลัง
 แบ่ งเป็ น 3 ประเภท
1. Genomic DNA library : ห้ องสมุด cloned DNA ของ 1
genome ซึ่งคือ genes ทั้งหมดของ สิ่ งมีชีวติ ใด ๆ เช่ น
human genome library
2. cDNA library : ห้ องสมุด cloned cDNA ของ structural
gene ใด ๆ
3. Chromosome-specific DNA library : ห้ องสมุด cloned
DNA ของ 1 chromosome

3
3
Application ของ Gene Recombinant Technology
1. Physical maps / restriction maps of DNA
molecule
หาแผนผังตาแหน่ งของ gene บน chromosomes
2. Nucleotide sequences of gene
หาลาดับ base ของ gene
3. In vitro site-specific mutagenesis
ศึกษาการทางาน และการควบคุมของ genes โดย การ
ทา mutation เฉพาะ base(s)
3
4. Identification of genes
ชี้บอก gene และรายละเอียดของ gene เช่ น gene ทีท่ าให้
เป็ นโรค
5. Human gene therapy
รักษาโรคทางพันธุกรรม โดยหลังวิเคราะห์ ได้ ว่า gene ใด
เป็ นเหตุของโรค นา gene หรือผลผลิต (protein) ของ
gene นั้นใส่ หรือใช้ ทดแทน
ป้องกันโดยไม่ ให้ gene(s) เป็ นสาเหตุของโรครุนแรงถ่ าย
ถอด
3
6. Production of proteins
ผลิต proteins, hormones และ enzymes ใช้ bacteria ซึ่ง
เป็ น host ของ recombinant DNA เป็ นผู้ผลิตให้ โดยไม่ ต้อง
สกัดจากสิ่ งมีชีวติ ชั้นสู งโดยเฉพาะสั ตว์
7. Transgenic organisms (plants & animals) หรือ GMO
(Gene modified organism)
crown gall, herbicide และ insecticide resistant plants
เช่ น
ข้ าว ข้ าวโพด ถั่วเหลือง มะเขือเทศ มันฝรั่ง หนู (ทดลอง)
ฯลฯ
9. Paternity tests & forensic application
DNA fingerprints หาความเป็ นพ่อ-แม่ หาคนร้ าย
3
ตัวอย่ างการประยุกต์ ใช้
Gene Recombinant Technology
4
Genetic
Maps
4
DNA Sequencing
4
Cloning Growth Hormone Gene
4
Gene Therapy : รักษาโรคทางพันธุกรรม
4
Transgenic Animal
การเตรียมฉีด DNA ด้ วย
microinjection เข้ าไปในไข่
Transgenic mouse (ซ้ าย)
4
Transgenic Plants
Glyphosate-tolerant petunia Luciferase plant พืชเรื องแสง
4
DNA Fingerprintings : Identify บุคคล / พ่อ-แม่
การเตรียม DNA
Fingerprintings
4
หาพ่อ - แม่
หาคนร้ ายจากผู้ต้องสงสัย
4
Cell Cloning
ให้ เป็ น cloned animal
1. แยก cell จากสั ตว์ ทโี่ ตเต็มวัยแล้ ว
2. Fuse รวมกับ unfertilized egg ที่ ได้ เอา nucleus ออก
แล้ ว
3. กระตุ้นให้ แบ่ งเซลล์ กลายเป็ นตัวอ่ อน (embryo)
4. นาฝากใส่ มดลูกของสั ตว์ ตัวเมียทีพ่ ร้ อมตั้งครรภ์ l

4
5