Transcript Gene Manipulation 1

Gene Manipulation
1
Gene Manipulation
การจัดการหรื อตัดแต่ง genetic materials โดยตัดต่อ
ระหว่างโมเลกุล DNA จากแหล่งที่ต่างกัน ได้ DNA
โมเลกุลใหม่เป็ นโมเลกุลผสม เรี ยกว่า
Recombinant DNA
วิธีการทาหรื อ methodology เรี ยกว่า
Recombinant DNA technology หรื อ
Genetic engineering หรื อ Gene cloning
* Clone หมายถึง ประชากรของสิ่ งที่เหมือน
2
หลักการทา Gene Cloning
1. เลือก DNA โมเลกุลที่ตอ้ งการ clone เรี ยกว่า
Foreign DNA และเลือก DNA โมเลกุลที่นาหน้า
ที่เป็ นพาหะ เรี ยกว่า Vector DNA
แยกตัด foreign DNA และ ตัด vector DNA ด้วย
enzyme ชนิดเดียวกัน
Enzyme ที่ใช้เรี ยกว่า Restriction enzyme
3
หลักการทา Gene Cloning (ต่อ)
2. เลือกท่อน (fragment) ของ cut foreign DNA
ขนาดพอเหมาะที่จะ clone โดย วิธีแยกใน
สนามไฟฟ้า Electrophoresis ซึ่งจะให้แถบ
(bands) ของ DNA ขนาดต่าง ๆ กัน
แล้วตัดและแยกแถบที่ตอ้ งการออกมาสกัดแยก
ให้ได้ DNA fragment ที่ตอ้ งการ
4
หลักการทา Gene Cloning (ต่อ)
3. Insert DNA fragment เข้าไปในโมเลกุลของ
cut vector DNA ด้วย enzyme Ligase จะได้
DNA ผสมโมเลกุลใหม่ เรี ยกว่า Chimeric
DNA หรื อ Recombinant DNA
4. Introduce Recombinant DNA เข้าไปใน host
cells ของ cloning vector โดยวิธี transformation
หรื อ วิธีอื่น ๆ
host cells โดยทัว่ ไปใช้ E. coli และ yeast
5
Recombinant DNA
First cloning
Principle of cloning
6
หลักการทา Gene Cloning (ต่อ)
5. Recombinant DNA ภายใน host จะแบ่งตัวเพิม่
จานวนและถ่ายทอดไปพร้อมกับการแบ่งตัวเพิ่ม
จานวนของhost ทาให้ได้ identical copies ของ
recombinant DNA จานวนมาก เรี ยกว่า
Amplification
6. ทาการตรวจเลือกหา (screening) host cells มี
recombinant DNA
7
Cloning Vectors
1. Plasmid
2. Bacteriophage
3. Cosmid
4. Phagemid
5. Artificial chromosome
8
1. Plasmid vectors
Plamids เป็ น extrachromosome ใน
microorganisms โดยเฉพาะ bacteria
 เป็ น double-stranded circular โมเลกุล
 ขนาด ~ 1 kb (1 kb = 1000 bp) ถึง 200 kb
 มี antibiotic-resistance genes ที่สามารถใช้เป็ น
markers สาหรับคัดเลือก cloning ที่ positive
 pBR322 เป็ น plasmid ตัวแรกที่ใช้ใน cloning

9
1.1
pBR322
 ขนาด
43. Kb
มี Ampicillin resisteant
gene และ Tetracyclin
resistant gene
 มี restriction sites มากและ
ง่ายต่อการใช้ทา cloning
เช่น EcoRI, PstI, BamHI
 มี Origin of replication
 นาเข้า bacteria โดย
Transformation

pBR32
2
10
Cloning in pBR322
Amplification
11
1.2
pUC8
Plasmid ที่ carry 2 markers
1. lacZ gene code ให้ bgalactosidase และ
2. Amplicillin resistant
gene
 culture E.coli host ใน Xgalactopyranoside
(5-bromo-4-chloro-3indolyl-b-Dgalactopyranoside) 12

1.3 Yeast episomal plasmids / YEps
2 um plasmid
ขนาด 6 kb
 มี gene resist
ต่อ inhibitors
เช่น copper และ methotrexate
 ใช้ leu2 gene เป็ น marker

13
Cloning in yeast
14
1.4 Ti plasmid
Ti plasmid หรื อ T-DNA ใน
Agrobacterium tumefaciens
ในดิน
 integrate เข้า
plant chromosomal
DNA
 produce callus
หรื อ cancer growth หรื อ crown gall
ในพืช

15
Plant clonimg
using Ti
plasmid
16
2. Bacteriophage vectors
Double-stranded virus ที่บางระยะอยูใ่ นรู ป Linear
duplex ได้
 ส่วนมากใช้ Bacteriophage Lambda(l) ขนาด ~
50 kb
 ใน Linear duplex form ที่บริ เวณปลายสุ ดทั้ง 2 ข้าง
ของเส้นเป็ นช่วง Single strand ขนาด 12
nucleotides เรี ยกว่า Cohesive ends หรื อ COS sites
 Cos sites ทา complementary ต่อกัน ให้ได้ circular
duplex DNA ก่อน pack เข้า capsule กลายเป็ น
bacteriophage

17
2.1 Charon phage vector
l มี genes ~ 50 % ที่
จาเป็ นต่อ growth
 l package DNA ให้
เป็ น circular form ได้
78-105 %
 l vector รับ insert ได้
12-25 % จึงเหมาสาหรับ
clone eukaryote เช่น ทา

Genomic library
18
2.2 M13
vector
 single-stranded phage
 Rolling circle replication
 รับ insert ที่เป็ น
single-stranded version ของ cloned gene
ระหว่าง 300-1000 bases
 ใช้ cloning เพื่อ sequence DNA
19
3. Cosmid
vector
Vector ที่ construct จากส่ วนของ
1. Plasmid : drug-resistant marker, origin of
replication และ restriction sites จึงมี replication
ได้เหมือน plasmid
2. l phage : cos sites สาหรับ packaging cloned
DNA ให้เป็ น phage chromosome ใน in vtro
20
cosmid มีขนาด 4-6
kb
 cosmid สามารถรับ
insert foreign DNA
ได้ระหว่าง 35 - 50 kb
เหมาะในการ clone
gene ขนาดใหญ่ของ
eulararyote

Cosmid vector
21
4. Pagemid vectors
Vector ที่ construct ให้มี characteristics คล้าย
cosmid คือ มีท้ งั ของ phage และ plasmid
มี multiple cloning site insert เข้าที่ lacZ gene
มี origin of replication จาก single-stranded f1 คล้าย
M13 ทาให้ package ได้ single-stranded
phagemid DNA
22
Transcription vector / Bluescript vector / pBS
มี Multiple cloning site
 มี 2 RNA polymerase
promoters คือ
T3 promoter ข้างหนึ่ง
และ T7 promoter
อีกข้างหนึ่ง
 สามารถ transcribe RNA ใน in vitro
 ใช้ศึกษา translation in vitro

23
5. Artificial chromosome
เป็ น Construct เพี่อทา cloning ใน yeast เรี ยกว่า
Yeast Artificial chromosome / YAC
เป็ น mini-chromosome ประกอบด้วย
1 centromere, 2 telomeres, origin of replication,
และ seletable marker gene(s)
ใช้ศึกษา chromosome segregation ระหว่าง meiosis
และ cloning DNA ขนาดใหญ่ได้ถึง 150 kb
24
Yeast artificial
chromosome
vector
YAC vector
25
DNA manipulative enzymes
Enzymes ที่ใช้ตดั DNA อย่าง specific และต้อง
บริ สุทธิ์ มี 2 ชนิดหลัก
1. Restriction endonucleases
2. DNA ligases
26
Restriction Endonuclease




Type II restriction endonuclease
recognize specific nucleotide sequences
cut 4-8 nucleotide sequence
cut ends 2 types
 Blunt ends เช่น AluI
 Stricky ends เช่น EcoRI
27
Cut ends by restriction endonucleases
28
DNA ligase
เชื่อม DNA โมเลกุล
ระหว่าง
Sticky ends : efficiency
ค่อนข้างดี
Blunt ends : efficiency
น้อยกว่า
29
DNA library
คือ Set ของ DNA clones ที่เก็บไว้ท้ งั หมดเพื่อใช้
ตรวจหาและศึกษา genes
 Genomic DNA library : ของ 1 genome ซึ่ งคือ
genes ทั้งหมดของ สิ่ งมีชีวติ ใด ๆ
 Chromosome-specific DNA library : ของ 1
chromosome
 Complementary DNA library : ของ cDNA
30
Application ของ Gene manipulation
1. In vitro Site-specific mutagenesis : ศึกษา
การทางานของ genes
2. Physical maps / restriction maps of DNA
molecule
3. Nucleotide sequences of gene : หาลาดับ
base ของ gene
4. Identification of genes : genetic diseases
5. Human gene therapy : รักษาโรคทาง
พันธุกรรม
31
6. Paternity tests : DNA fingerprints, forensic
application
7. Production of proteins : hormones,
enzymes
8. Transgenic plants : crown gall, herbicide
และ insecticide resistant plants
9. Transgenic animals : protein production for
human สามารถผลิตเป็ นการพาณิ ชย์ได้
32
ตัวอยา่ ง การประยุกต์ใช้
Gene cloning
33
DNA Sequencing
34
Cloning in Plants
Glyphosate-telerant petunia Luciferaseplant พืชเรื องแสง
35
DNA Fingerprintings : Identify บุคคล / พ่อ-แม่
36
Gene Therapy : รักษาโรคทางพันธุกรรม
37
Gene Transfer : ต้อง Identify gene ให้
ถูกต้องก่อน โดยเทคนิค gene cloning
38
Transgenic
mouse
39
Production ของ Somatostatin (action คล้าย growth
hormone) ใน recombinant E.coli
40