Transcript 第十章、蛋白质和氨基酸的测定

第十章 蛋白质和氨基酸的测定
西昌学院轻化工程学院
第一节 概述
1、蛋白质概况
蛋白质是生命的物质基础，人体11%~13%总热量
来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质，只是
含量及类型不同。
蛋白质是食品的最重要质量指标，其含量与分解
产物直接影响食品的色、香、味。
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2、测定意义
是食品的重要营养指标。
人体组织的构成成分。
构成体内各种重要物质，维持体内酸碱平衡
是评价食品质量高低的指标，还关系到人体健康。
不同食品中蛋白质的含量不同，可作为质量检验的
一种重要手段。
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3、蛋白质的测定方法分两大类：
一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折
射率等测定蛋白质含量；
另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和
碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。
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第二节
蛋白质的定性测定
一、蛋白质的一般显色反应
电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合
并变色。书中列举了 5 种染料。
二、复合蛋白质的显色反应
（一）糖蛋白的显色（3种方法）
（二）脂蛋白的显色（2种方法）
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第三节
蛋白质的定量测定
一、 凯氏定氮法
这种方法是1883年Kjeldahl发明，当时凯氏只
使用H2SO4来分解试样，来定量谷物中的蛋白质的
方法。
凯氏定氮法是先测定总氮量，然后乘以蛋白质
换算系数，即可得到粗蛋白质含量。而一般来说，
食品中蛋白质的含氮量为16％，所以测得的含氮量
再乘以6.25，就能得到蛋白质的含量。
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（一）常量凯氏定氮法
1、原理
样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，
其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有
机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使
氨蒸出。

①用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸
消耗量可以计算出蛋白质的含量。

②也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再
以标准NaOH滴定过量的酸。

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2、仪器和试剂
仪器：500ml凯氏烧瓶、定氮蒸馏装置
试剂：硫酸铜；硫酸钾；硫酸；40g/L硼酸溶液；
400g/L氢氧化钠；0.1mol/L盐酸标准溶液。
混合指示剂：（国标）1g/L甲基红乙醇溶液与
1g/L甲基蓝乙醇溶液，临用时按2：1的比例混合；
或者1g/L甲基红乙醇溶液与1g/L溴甲酚绿乙醇溶
液，临用时按1：5的比例混合。
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3、步骤：消化、蒸馏、吸收与滴定
（1）样品消化：总反应式
2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4
（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O
浓硫酸的作用：


脱水作用：使有机物脱水并碳化为C、H、N
氧化作用：将有机物炭化后的C、H氧化为CO2
和H2O，硫酸则被还原成SO2，而蛋白质则分解
为氨，与硫酸结合成硫酸铵，留在酸性溶液中。
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在消化反应中，为了加速蛋白质的分解，缩短
消化时间，常加入下列物质:
 硫酸钾：作为增温剂，提高溶液的沸点而加快有机物分解。
也可以加人硫酸钠、氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不
如硫酸钾。
 硫酸铜CuSO4：作为催化剂,还可指示消化终点的到达
（做蒸馏时碱性指示剂） 。
 加氧化剂：如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧化速度。
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消化装置
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样品消化：
准确称取均匀的固体样品0.5-3g,或半固体样品
2-5g,或吸取溶液样品15-25ml→小心移入干燥的凯氏
烧瓶中(勿粘附在瓶壁上) →加入0.5-1g硫酸铜、10g
硫酸钾及25ml浓硫酸→小心摇匀后→于瓶口置一小漏
斗，瓶颈45°角倾斜置电炉上加热消化。
先以小火缓慢加热，待内容物完全炭化、泡沫消
失后→加大火力消化至溶液呈蓝绿色→取下漏斗，继
续加热0.5h →冷却至室温。
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（2）蒸馏与吸收
消化液 + 40%
氢氧化钠加热
蒸馏，放出氨
气。
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蒸馏、吸收：
按图装好蒸馏装置,冷凝管下端浸入接受瓶液
面之下（瓶内预先装有50ml 40g∕L硼酸溶液及混
合指示剂5－6滴）。
在凯氏烧瓶内加入100ml蒸馏水、玻璃珠数粒
→从漏斗中慢慢加入70-80ml 40%氢氧化钠，溶液
应呈蓝褐色→摇动至溶液深蓝色→在凯氏烧瓶内加
入100ml蒸馏水→加热蒸馏→至氨全部蒸馏出来为
止(蒸馏液约250ml) →将蒸馏装置出口离开液面继
续蒸馏1min，用蒸馏水淋洗尖端后停止蒸馏。
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（3）滴定:
将接受瓶内的硼酸液用0.1mol/L盐酸标准溶
液滴定至终点(溶液变为微红色)。同时做一试剂
空白（除不加样品，从消化开始操作完全相同）。
c（V1  V2） 0.014  F
蛋白质含量（ g / 100g ）
100
m
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（4）注意及说明
所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制
消化时不要用强火，应保持和缓沸腾
消化过程中应注意不时转动凯氏烧瓶
样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生
大量泡沫 ,采取相应的方法预防
当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷
却，加入30％过氧化氢 2-3 m1 后继续加热消化。
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若取样量较大，如干试样超过5g,可按每克试样
5mL的比例增加硫酸用量
一般消化至呈透明后，继续消化30min即可,但对
于含有特别难以氨化的氮化合物的样品,适当延长
消化时间
蒸馏装置不能漏气
硼酸吸收液的温度不应超过40 ℃
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蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管
口，再蒸1 min后关掉热源
蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧
化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量；氢氧化
铜在70～90℃时发黑。
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（二）微量凯氏定氮法
1、原理及适用范围同前
2、与常量法不同点：
加入硼酸量有50 ml
10 ml
滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L
0.01 mol/L
可用微量滴定管
3、蒸馏装置见 159 页图 10-2 。
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10-2
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4、说明与注意:
①蒸馏前给水蒸气发生器内装水至2/3容积处，加甲
基橙指示剂数滴及硫酸数毫升
②20g/L硼酸吸收液每次用量为25 mL，用前加入甲
基红-溴甲酚绿混合指示剂两滴。
③在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不
得停火端气，否则将发生倒吸。加碱要充足，操
作要迅速，漏斗应采用水封措施，以免氮由此逸
出损失。
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（三）自动凯氏定氮法
1、原理及适用范围同前
2、特点：
（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热
的消化炉。
（2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消化完毕。
（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显
示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完成1个样。
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二、其他测定方法
传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、
准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。
新开发的：
双缩脲法
紫外分光光度法
染料结合法
水杨酸比色法等
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1、双缩脲法：

双缩脲的性质：当脲被小心地加热至150～160℃时，可由
两个分子间脱去一个氨分子而生成双缩脲，其与碱及少量
硫酸铜溶液作用生成紫红色的配合物，此反应称为双缩脲
反应

测定原理：蛋白质分子中肽键（—CO—NH—）与双缩脲结
构相似，也能呈现此反应而生成紫红色配合物，在一定条
件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比，用吸收光度法来测
定蛋白质含量，最大吸收波长为560nm。

特点：简单快速，灵敏度低，常用于生化领域。
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2、分光光度法测定蛋白质含量

原理：试样与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分
解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。在pH=4.8的乙酸
-乙酸钠缓冲溶液中，铵与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色
的化合物。在波长400nm处测定吸光度，与标准系列比
较定量，结果乘以蛋白质系数，即为蛋白质含量。

氨氮标准溶液（1.0g/L）：精密称取经105℃干燥的硫酸
铵0.4720g，用水溶解并定容至100mL ,临用时用水稀释
至0.1g/L
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3、染料结合法：

原理：在特定的条件下，蛋白质可与某些染料
定量的反应生成沉淀，用分光光度计测定沉淀
反应完全后剩余的染料量可计算出反应消耗的
染料量，进而求得样品中蛋白质的含量。

适用于牛乳、冰淇淋、乳酪、巧克力饮料等食
品。
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4、水杨酸比色法

原理：样品中的蛋白质经硫酸消化而转化成铵盐
溶液后，在一定的酸度和温度条件下可与水杨酸
和次氯酸钠作用生成兰色化合物，在660nm处比
色测定，求出样品的含氮量，进而计算出蛋白质
的含量。
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第四节 氨基酸的定量测定
 蛋白质可以被酶、酸或碱水解，其水解的最终
产物为氨基酸。氨基酸是构成蛋白质的最基本物
质，构成蛋白质的氨基酸主要是其中的20种，它
们对人体有着极其重要的生理功能，常会因其在
体内缺乏而导致患病或通过补充而增强了新陈代
谢作用。
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一、甲醛滴定法
1、原理
 氨基酸本身有碱性—NH2—基，又有酸性—COOH 基，成
中性内盐，加入甲醛溶液后，与—NH2— 结合，碱性消
失，再用强碱来滴定—COOH 基，用间接的方法测定氨基
酸的总量。
2、特点
 适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其发酵过程中氮
量减少情况等。（适于食品中游离氨基酸的测定）
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3、双指示剂：
① 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用
氢氧化钠将40%甲醛中和至蓝色。
② 0.1%百里酚酞乙醇溶液，
③ 0.1%中性红50%乙醇溶液，
④ 0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液。
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4、操作方法
 ①预处理：移取含氨基酸约20～30mg的样品溶液2份
 ②中和游离酸（用中性红作指示剂，先测定其它游离酸
的含量）：其中1份加入3滴中性红指示剂，用0.1mol/L
氢氧化钠标准溶液滴定至由红变为 琥珀 色为终点，记
录V1
 ③滴定氨态氮（用百里酚酞作指示剂测定氨基酸和游离
酸的总含量）：另1份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲
醛20mL，摇匀，静置1分钟，用0.1mol/L氢氧化钠标准
溶液滴定至淡蓝色为终点，记录V2
二者之差可计算氨基酸含量
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5、结果计算
c(V2  V1 )  0.014
W
 100%
m
式中：c ——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L;
V1——用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶
液的体积，mL;
V2——用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准
溶液的体积，mL;
m——测定用样品溶液相当于样品的质量，g
0.014——氮的毫摩尔质量，g/mmol
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6、 说明及注意事项
 此法适用于测定食品中游离的氨基酸
 固体样品应先进行粉碎，准确称取后用水萃取， 50℃水
浴中萃取0.5h即可。液体样品可直接进行测定。
 若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定，或用
电位滴定法进行测定。
 与本法类似的还有单指示剂（百里酚酞）甲醛滴定法，
此法用标准碱完全中和-COOH 时的pH为8.5~9.5，但分
析结果稍偏低，即双指示剂法的结果更准确。
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二、茚三酮比色法
 1、原理：水合茚三酮与氨基酸反应，水合茚三酮被还原
成还原型水合茚三酮，氨基酸被氧化脱羧，产生醛、二氧
化碳和氨。氨与水合茚三酮、还原型水合茚三酮作用生成
蓝紫色化合物(除脯氨酸外均有此反应)，该化合物的颜色
深浅与氨基酸的含量成正比。
 在570nm处测吸光度，用氨基酸标准溶液绘制标准曲线。
 样品溶液需澄清，通常采用活性炭脱色处理。
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2、操作方法
（1）标准曲线绘制
准确吸取相当于0、100、200、300、400、500、600μg氨
基酸(单或混合氨基酸)标准溶液，分别置于25mL容量瓶
或比色管中，各加水补充至容积为4.0mL，然后加入茚三
酮溶液（20g/L）和磷酸盐缓冲溶液（pH为8.04）各1mL，
混合均匀，于水浴上加热15min，取出迅速冷至室温，加
水至标线，摇匀。静置15min后，在570nm波长下，以试
剂空白为参比液测定各溶液的吸光度A。绘制标准曲线。
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（2）样品测定
• 吸取澄清的样品溶液1～4mL，按标准曲线制作步
骤，在相同条件下测定吸光度A值，用测得的A值
在标准曲线上可查得对应的氨基酸微克数。
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3、说明及注意事项
①通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎样
品5～10g或吸取样液样品5～10mL，置于烧杯中，
加入50mL蒸馏水和5g左右活性炭，加热煮沸，
过滤，用30～40mL热水(磷酸缓冲液效果如何
呢?)洗涤活性炭，收集滤液于100mL容量瓶中，
加水至标线，摇匀备测。
②茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影响而被
氧化呈淡红色或深红色，使用前须进行纯化.
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第五节
氨基酸的分离与测定
薄层色谱法
氨基酸自动分析仪
气相色谱法
液相色谱法
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一、薄层色谱法（薄层层析法（TLC 法）
1、原理：
取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，
在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层
板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质
具有相同的Rf值，不同成分则有不同的Rf值，因而各种
混合物可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，
与标准氨基酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色
斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。
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 Rf = a /
b
溶剂前沿
b
样点
a
点样原点
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 优点：
① 展开时间短，一般在20—30分钟，展开距离通常只需
10cm，且分离效果好。
② 层析后得到的斑点小而清晰。
③ 能够使用多种显色剂。
④ 点样量少，灵敏度高。（比纸层析高10—100倍）精确到
0.01ug。
⑤ 也可用于大量分离＞500mg，作为样品制备层析。
 缺点：Rf值重现性比纸上层析差。
 分类：按层析的原理可分为：吸附、分配、离子交换、
凝胶等。
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2、操作方法：
① 薄层板制备
② 样品液制备
③ 点样：距薄板底端2cm处，用针画一标记作为原点。再
以点样距扳子宽窄可点几个点同时展开，点与点之间间隔
1～2cm。
a.可用毛细玻璃管、微量吸管或微量注射器。注意要等
一个点干了再点另一个点。
b.用一小直径ф3mm 滤纸片，浸入样液，埋到板子上先
挖好一个小洞穴。
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④ 展开：点样完了，放入密闭容器中（展开槽），倾斜一
定角度10～30°，下端浸入展开剂1cm，千万别让溶剂浸过
了样点。到离顶端一部分，取出样板、晾干、显色。
a.展开剂的有关情况：主要是低沸点的2～3种有机溶剂组
成的溶剂系统，分离效果主要决定于展开剂的选择，因为
吸附剂在一定情况下是恒定的，吸附剂的选择余地远远小
于展开剂的选择。
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b.展开剂的选择方法：
Ⅰ.微量圆环法。
Ⅱ.用小载波片试验，微量展开剂展开5cm。
Ⅲ.图解法：
样品极性小，选吸附剂活性高，展开剂极性低的。
样品极性大，选吸附剂活性低，展开剂极性高。
 有机溶剂极性由小到大为：
石油醚、环己烷、四氯化碳、三氯乙烷、甲苯、苯、二氯
甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、正丙醇、乙醇、
甲醇、水、吡啶、有机酸类等。
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c.展开的方式：
上行法、下行法、双向展开、单向多次展开、双向多
次展开。
双向展开：
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⑤ 显色：
a.喷适当的溶液，使斑点显色，即喷雾显色。
b.喷有荧光反应的物质，在紫外光下观察斑点。
c.将涂有荧光指示剂的薄层板放在紫外灯下观察。
（涂板时把荧光指示剂加入到固体吸附剂中）
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定性：在同一块板上，同等条件下操作，被测样与标准
样同时展开、显色，同Rf值即是；
查手册找相同的 Rf 值。
定量：a.目视定量法：以标准斑点对照，相当于样品斑
点中含量ug数。
b.斑点面积定量法。
c.将样点取下来，定容，离心，比色。
d.利用薄层色谱扫描仪：
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二、氨基酸自动分析仪分析
原理：食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，
经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮
溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定
氨基酸含量。一份水解液可同时测定天冬，苏，
丝，谷，脯，甘，丙，缬，蛋，异亮，亮，酪，
苯丙，组，赖和精氨酸等16种氨基酸，其最低检
出限为10pmol。
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 操作步骤
 样品处理：样品采集后用匀浆机打成匀浆（或者将样品
尽量粉碎）于低温冰箱中冷冻保存，分析用时将其解冻
后使用。
 称样：准确称取一定量样品，精确到0.0001g。均匀性好
的样品如奶粉等，使样品蛋白质含量在10～20mg范围内；
均匀性差的样品如鲜肉等，为减少误差可适当增大称样
量，测定前再稀释。将称好的样品放于水解管中。
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 水解：在水解管内加6mol/L盐酸10～15mL（视样品蛋白质
含量而定），含水量高的样品（如牛奶）可加入等体积的
浓盐酸，加入新蒸馏的苯酚3～4 滴，再将水解管放入冷冻
剂中，冷冻3～5min，再接到真空泵的抽气管上，抽真空
（接近0psi），然后充入高纯氮气；再抽真空充氮气，重
复三次后，在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖将已封口的
水解管放在110±1℃的恒温干燥箱内，水解22h后，取出冷
却。打开水解管，将水解液过滤后，用去离子水多次冲洗
水解管，将水解液全部转移到50mL容量瓶内，用去离子水
定容。吸取滤液1mL于5mL容量瓶内，用真空干燥器在40～
50℃干燥，残留物用 1～2mL水溶解，再干燥，反复进行两
次，最后蒸干，用1mL pH2.2的缓冲液溶解，供仪器测定用。
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测定：准确吸取0.200mL混合氨基酸标准，用
pH2.2的缓冲液稀释到5mL，此标准稀释浓度为
5.00 nmol/50μL，作为上机测定用的氨基酸标
准，用氨基酸自动分析仪以外标法测定氨基酸
含量。
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三、气相色谱法
原理
将本身没有挥发性的氨基酸转变为适合于气相色谱分析的
衍生物——三氟乙酰基正丁酯。它包括用正丁醇的酯化和
用三氟乙酸酐（TFAA）的酰化两个步骤。将酰化好的氨基
酸衍生物进行气相色谱分析。
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四、高效液相色谱法
高效液相色谱法适于分析沸点高、分子量大、热稳定性差
的物质和生物活性物质。
由于大多数氨基酸无紫外吸收及荧光发射特性，而紫外吸
收检测器（UVD）和荧光检测器（FD）又是HPLC仪的最常
用配置。故人们需将氨基酸进行衍生化，使其可以利用紫
外吸收或荧光检测器进行测定。
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思考题
1、试述蛋白质测定中，样品消化过程所必须注意的事项，
消化过程中内容物颜色发生什么变化？为什么？
2、样品经消化进行蒸馏前，为什么要加入氢氧化钠？这时
溶液发生什么变化？为什么？如果没有变化，说明什么
问题？须采用什么措施？
3、硫酸铜及硫酸钾在测定中起了什么作用？
4、试述氨基酸态氮的测定原理。
5、结果计算中为什么要乘上蛋白质系数？
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