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食品化学与分析 第十一讲 食品蛋白质及氨基酸的测定 食品化学与分析 第一节 概述 1. 蛋白质概况 蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主 要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些蛋白 质中还含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。 在食品和生物材料中常包括蛋白质，可能还包 括有非蛋白质含氮的化合物，（如核酸、含氮 碳水化合物、生物碱等；含氮类脂、卟啉和含 氮的色素）。 食品化学与分析 第一节 概述 食品中蛋白质的含量 食物名称 猪 肉（肥瘦） 牛 肉（肥瘦） 羊 肉（肥瘦） 马肉 驴肉 兔肉 牛乳 乳粉（全） 鸡 鸭 鸡蛋 大黄鱼 小黄鱼 带鱼 鲐鱼 鲤鱼 蛋白质含量 9.5 20.1 11.1 19.6 18.6 21.2 3.3 26.2 21.5 16.5 14.7 17.6 16.7 18.1 21.4 17.3 食物名称 稻米 小麦粉（标准) 小米 玉米 大豆 大白菜 油菜（秋） 油菜（春） 菠菜 黄瓜 苹果 桃 柑桔 鸭梨 蛋白质含量 8.3 9.9 9.7 8.5 36.3 1.1 1.2 2.6 2.4 0.8 0.4 0.8 0.9 0.1 食品化学与分析 第一节 概述 测定蛋白质最基本的方法是通过先测定样品中 的总氮量，再由总氮量计算出样品中的蛋白质 含量。 食品和其原料中蛋白质含量的测定，主要（也 是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量和杜马 法。 这里也包括非蛋白的氮，所以只能称为粗蛋白 的含量（但马铃薯等非蛋白氮多的要单测）。 食品化学与分析 第一节 概述 一些蛋白质的含氮量 蛋白质 氮(克) 蛋白质 氮（克） 肌动蛋白（兔肌肉） 16.7 谷蛋白（小麦） 17.6 清蛋白（牛血） 16.07 血红蛋白（马） 16.8 清蛋白（鸡蛋白） 15.9 胰岛素A（牛肉） 15.88 α-淀粉酶 16.23 β –乳球蛋白(牛乳) 15.64 抗生物素蛋白(鸡蛋白) 14.80 溶菌酶（鸡蛋白） 18.80 全酪蛋白（牛乳） 15.63 肌球蛋白（兔肌肉） 16.70 胶原（蛋白）（牛皮） 18.70 木瓜蛋白酶（木瓜） 17.15 伴清蛋白（鸡蛋白） 16.6 核糖核酸酶A（牛胰） 17.51 白明胶（小牛皮） 18.1 鲑精蛋白（鲑精液） 31.5 麦醇溶蛋白（小麦） 17.66 胰蛋白酶（牛胰） 16.95 球蛋白（南瓜籽） 18.55 色氨酸合成酶 17.5 胰岛血糖素（猪） 17.29 玉米醇溶蛋白(玉米) 16.2 食品化学与分析 第一节 概述 • 一些蛋白质的含氮量 一般为 15%~ 17.6%，有的上下浮动可 以测出总氮 N N = N×6.25 = 蛋白质含量 16% 食品化学与分析 第一节 概述 2.蛋白质定量法 定氮法 利用蛋白质共性的方法 双缩脲法 物理法 染料结合法 利用特定氨基酸残基法 福林—酚试剂法 凯氏定氮法——最常用的，国内外应用普遍。 食品化学与分析 第二节 蛋白质的测定 一、凯氏定氮法 由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、微量、自动 定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。书中只介绍前 三种。 1.原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化(digest)，使 蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸 出。 而样品中的有机氮(organic nitrogen)转化为氨与 硫酸结合成硫酸铵。 然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准 盐酸或硫酸溶液滴定。 食品化学与分析 第二节 蛋白质的测定 整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定 （1）消化 总反应式： 2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O 一定要用浓硫酸（98%） <1>加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点 340℃， 加入硫酸钾之后可以提高至400℃以上。也可加入硫酸钠， 氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。 食品化学与分析 第二节 蛋白质的测定 <2> 加硫酸铜 作为催化剂。还可以作消化终 点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。还可以加 氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧 化钛。 <3> 加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有 机 物氧化速度。 食品化学与分析 消化装置 “自动回流消化仪” 第二节 蛋白质的测定 食品化学与分析 （2）蒸馏 消化完全的样品溶液， 浓氢氧化钠使呈碱性， 加热蒸馏，即可释放 出氨气 (NH4)2SO4+2NaOH→ NH3+Na2SO4+2H2O 第二节 蛋白质的测定 食品化学与分析 第二节 蛋白质的测定 (3）吸收与滴定(titration) 吸收：加热蒸馏所放出的氨，硼酸溶液 滴定：盐酸标准溶液， 2 NH 3 4 H 3 BO 3 ( NH 4)2 B 4O 7 5H 2O ( NH 4)2 B 4O 7 5H 2O 2 HCl 2 NH 4Cl 4 H 3 BO 3 硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.8×10-10 ），用酸滴定不 影响指示剂的变色反应，它有吸收氨的作用 也可采用硫酸或盐酸标准溶液吸收，然后再用氢氧化 钠标准溶液反滴定吸收液中过剩的硫酸或盐酸，从 而计算总氮量 食品化学与分析 第二节 蛋白质的测定 2、适用范围（application) 此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定。 3、试剂 浓硫酸：脱水、氧化 硫酸铜：催化剂及消化指示剂 硫酸钾：提高溶液的沸点 氢氧化钠 混合指示剂 硼酸 盐酸 食品化学与分析 第二节 蛋白质的测定 4、操作方法 （1）消化：固体样品0.2-2g，半固体样品2-5g， 液体样品10-20ml，加入催化剂及浓硫酸进行 消化至溶液绿色透明。（同时做空白实验） （2）蒸馏： 按装置进行连接，奈氏试剂检查，无红棕色物 质生成(检查氨是否全部蒸完)，蒸馏过程中用硼酸 吸收。 （3）滴定用0.1000mol/L盐酸滴定至由兰色变 为微红色。（甲基红为指示剂） 食品化学与分析 第二节 蛋白质的测定 5.蛋白质计算 (V1－V0) ×C×0.014×F×100 蛋白质=—————————————————— m×n V1－V0——滴定时所耗盐酸标准溶液的毫升数； C——标准盐酸溶液的当量浓度； 0.14——1毫升当量氮的克数； F——氮的蛋白质换算系数； m——样品克数。 n ——稀释倍数 食品化学与分析 第二节 蛋白质的测定 6.注意事项 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却， 加入30％过氧化氢 2—3 m1 后再继续加热消化。 消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴在 凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下 消化不完全而造成氮损失。 样品含脂肪或糖较多时，消化时间要长些。同时注 意消化过程中产生泡沫溢出瓶外。 在蒸馏过程中注意接头处有无松漏现象。 蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口， 再蒸1分钟后关掉热源．否则可能造成吸收液倒吸。 食品化学与分析 第二节 蛋白质的测定 二、 微量凯氏定氮法 1、原理及适用范围同前 2、与常量法不同点： 加入硼酸量有50 ml 10 ml, 滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L 可用微量滴定管。 3、蒸馏装置 0.01 mol/L , 食品化学与分析 第二节 蛋白质的测定 食品化学与分析 第二节 蛋白质的测定 三、 自动凯氏定氮法 1、原理及适用范围同前 2、特点： （1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红 外线加热的消化炉。 （2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可 消化完毕。 （3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自 动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录， 12分钟完成1个样。 食品化学与分析 第二节 蛋白质的测定 食品化学与分析 第二节 蛋白质的测定 四、双缩脲法 传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确， 不要大仪器，但费时间，有环境污染。 新开发的：双缩脲法、 紫外分光光度法、 染料结合法、 水杨酸比色法等。 • 都是快速测定蛋白质的方法 食品化学与分析 第二节 蛋白质的测定 1、原理 当脲（尿素NH2—CO—NH2）加热至150～ 160℃时，可由两个分子间脱去一个氨分 子而生成二缩脲（也叫双缩脲），反应 式如下： H2NCO NH2 H 150-160 N H CO NH2 H2NCONHCONH2 NH3 食品化学与分析 第二节 蛋白质的测定 • 双缩脲与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色 的配合物，此反应称为双缩脲反应 OH NH2 NH2 O=C NH 2 CuSO4 Cu H 2N O=C C=O NH HN NaOH O=C O =C NH2 C=O NH2Na NaH2N OH Ë«Ëõëå OH OH ×Ï ºì É«ÅäºÏ Îï 食品化学与分析 第二节 蛋白质的测定 蛋白质分子含有肽键, £¨ CO NH ) 与双缩脲结构相似，故也能呈现此反 应而生成紫红色配合物 在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含 量成正比，据此可用吸收光度法来测定蛋 白质含量，该配合物的最大吸收波长为 560nm。 食品化学与分析 第二节 蛋白质的测定 2.方法特点及应用范围 本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学 领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用 于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测 定 3.主要仪器： 分光光度计，离心机（4000 r/min） 4. 试剂： (1) 碱性硫酸铜溶液 (2) 四氯化碳 食品化学与分析 第二节 蛋白质的测定 5．操作方法： ① 标准曲线的绘制 采用凯氏法测出的蛋白质样品为标准样绘标准曲线。 显色（加入试剂静置1小时） 比色（取上清离心） ② 样品的测定 显色 比色 查标准曲线 食品化学与分析 6、结果计算 蛋白质（mg/100g）= 第二节 蛋白质的测定 c 100 m 式中：c—由标准曲线上查得的蛋白质mg数； m—样品质量，g 食品化学与分析 第二节 蛋白质的测定 7、说明及注意事项 ①蛋白质的种类不同，对发色程度的影响 不大，有大量脂肪存在时，会出现混浊可以先脱 脂 ②标准曲线作完整后，无需每次再作标准 曲线 ③样品含有脯氨酸且有大量糖类存在时，显色不好还 会出现结果偏低。 食品化学与分析 第二节 蛋白质的测定 五、紫外吸收法 1．原理：利用蛋白质的特有基团，对紫外光有 吸收作用在280 nm下，吸光度与蛋白质浓度成 直线关系，求含量。 R │ （— NH—CH—CO） 食品化学与分析 第二节 蛋白质的测定 2．适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰 因素多，故在食品分析领域应用不广泛。 3．主要仪器： ① 紫外分光光度计 ② 离心机（3000 — 5000 r/min） 4．操作：用凯氏法测定作标样做标准曲线 食品化学与分析 第三节 挥发性盐基氮的测定 挥发性盐基氮是指动物性食品由于酶和细菌的 作用，在腐败过程中，使蛋白质分解而产生氨 以及胺类等碱性含氮物质。此类物质具有挥发 性，在碱性溶液中蒸出后，用标准酸滴定计算 含量。 1.原理 挥发性盐基氮遇到弱碱氧化镁游离蒸馏出来， 蒸馏出来的氨，被硼酸吸收后生成硼酸铵，使 吸收液变为碱性，混合指示剂由紫色变为绿色。 再由标准盐酸滴定至紫色。 食品化学与分析 2 、试剂 2.1 氧化镁混悬液（ 10g/L ）：称取 1.0g 氧化镁，加 100mL 水，振摇成混悬液。 2.2 硼酸吸收液（ 20g/L ）。 2.3 盐酸 [c(HCL)=0.01mol/L] 或硫酸 [c(1/2H 2 SO 4 )=0.01mol/L] 的标准滴定溶 液。 2.4 甲基红乙醇指示剂（ 2g/L ）。 2.5 次甲基蓝指示剂（ 1g/L ）。 食品化学与分析 3.分析步骤 样品处理：精确取 10g 试样（粉碎好的样品）于 200mL 磨口三角瓶中，加 100.0mL(V 总 ) 蒸馏水 于振荡器上振荡 30 分钟， 4000 转离心。 蒸馏滴定：将盛有 2 0.0 mL 吸收液及 5-6 滴混合 指示液的锥形瓶置于冷凝管下端，并使其下端插 入吸收液的液面下，准确吸取 10.0mL （ V 分取 ） 上述样品上清液于蒸馏器反应室内，加 10 mL 氧 化镁混悬液（ 10g/L ），迅速盖塞，并加水以防漏 气，通入蒸汽，进行蒸馏，蒸馏 5min 即停止，吸 收滴定：吸收液用盐酸标准滴定溶液 0.01mol/L ） 或硫酸标准滴定溶液滴定，终点至蓝紫色。同时 做试剂空白试验。 食品化学与分析 4.计算式及结果表述： (V1-V0)×c×14 X= m×（5/100） ×100 食品化学与分析 第四节 氨基酸定量测定 一、甲醛滴定法 1、原理 氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的NH2 基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的 内盐。当加入甲醛溶液时，- NH2 基与甲醛结 合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标 准溶液来滴定-COOH基，并用间接的方法测定 氨基酸总量。 食品化学与分析 2、方法特点及应用 此法简单易行、快速方便。 在发酵工业中常用此法测定发酵液 中氨基氮含量的变化，以了解可被微生物利用 的氮源的量及利用情况，并以此作为控制发酵 生产的指标之一。 食品化学与分析 3、试剂 • 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂， 用氢氧化钠将40%甲醛中和至淡蓝色。 • 0.1% 百里酚酞乙醇溶液 • 0.1mol/L 氢氧化钠标准溶液 食品化学与分析 4、操作方法 样品溶液（氨基酸约20-30mg），+50ml蒸馏水 加入3滴百里酚酞指示剂+中性甲醛20ml，摇匀，静 置1分钟，0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定（淡兰 色，终点） 记录所消耗的碱液ml数。 食品化学与分析 5、结果计算 X＝（V2－VI）×C×0.014×100／V 式中：X为样品中氨基氮含量（g／100 g）； V2------百里酚酞作指示剂时消耗氢氧化钠标准液 的体积（ml）； V1----空白液消耗氢氧化钠标准液的体积（ml）； C------氢氧化钠标准液的浓度（mol／L）； V-------为样品液取用量（ml） 0.014-----为氮的毫摩尔质量（g/mmol） 食品化学与分析 • 6、说明及注意事项 • 此法适用于测定食品中的游离氨基酸。 • 固体样品应先进行粉碎，准确称样后用水萃取，然后测定萃 取液； • 液体试样如酱油、饮料等可直接吸取试样进行测定。萃取可 在500C水浴中进行0.5小时即可。 • 若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定，或用电位 滴定法进行测定。 • 与本法类似的还有单指示剂（百里酚酞）甲醛滴定法，此法 用标准碱完全中和-COOH基时的pH为8.5-9.5，但分析结果稍 偏低，双指示剂法的结果更准确。 食品化学与分析 • 误差 • 脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合 物，使结果偏低； • 酪氨酸含有酚羧基，滴定时也会消耗一 些碱而致使结果偏高； • 溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往 往使结果偏高。 食品化学与分析 二、电位滴定法 1、 原理 根据氨基酸的两性作用，加入甲醛 以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性， 将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插 入被测液中构成电池，用氢氧化钠标准 溶液滴定，依据酸度计指示的pH值判断 和控制滴定终点。 食品化学与分析 2、 仪器 酸度计、磁力搅拌器、微量滴定管 3、 试剂 20%中性甲醛溶液：参考甲醛滴定法试剂 0.05mol/L氢氧化钠标准溶液 4、操作方法 • pH8.2--计算总酸含量； • pH9.2--试剂空白试验。 食品化学与分析 5、 结果计算 • X=（V1－V2）×C×0.014×100／V • 式中：X为样品中氨基酸的含量（g/l00ml）； • V1--测定用样品加人甲醛稀释后消耗氢氧化钠标 准液的体积（ml）； • V2--试剂空白试验加人甲醛后消耗氢氧化钠标准 溶液的体积（ml）； • V--样品稀释液取用量（ml）； • C--氢氧化钠标准液的浓度（mol/L） • 0.014--氮的毫摩尔质量（g/mmol）。 食品化学与分析 6、 说明 • 本法准确快速，可用于各类样品游离氨 基酸含量测定 • 对于浑浊和色深样液可不经处理而直接 测定。 食品化学与分析 三、其他方法 1.茚三酮比色法(ninhydrin method) 原理 氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成 蓝紫色(Ruhemann purple color)化合物（除 脯氨酸外均有此反应）。该蓝紫色化合物的 颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收 波长为570nm，故据此可以测定样品中氨基酸 含量。 食品化学与分析 2.薄层色谱法（薄层层析法-TLC 法） 原理： 取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄 层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样 品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、 交换等作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成 分则有不同的Rf值，因而各种混合物可达到彼此 被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基 酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点 颜色的深浅可以大致确定其含量。 食品化学与分析 3.氨基酸自动分析仪法 4.气相色谱法 5.高效液相色谱法 食品化学与分析 小结 凯氏定氮法原理、分步、测定方法。 双缩脲法测定原理。 氨基酸总量的测定方法（甲醛滴定法）。