Transcript 9-10
הנדסה גנטית -9הנדסה גנטית מבוא עקרונות מטרות וישומים -10שיטות בסיסיות בהנדסה גנטית הגברה ושיכפול של מולקולות DNAע"י PCR – Polymerase Chain Reaction הגברה ושיכפול של מולקולות RNAע"י RT-PCR – Revearse Transcriptase יצירת cDNAמתעתיקי - RNAשימושים -11שיטות המשך אנזימי הגבלה -עקרונות ושימושים. שיבוט -החדרת מקטע DNAזר לתוך רצף-נשא/וקטור (פלסמיד ,או וירוס) הספגה Western, Northern, Southern Blot- ראקצית ריצוף – בדיקת רצף של חומצות גרעין. 13 12הנדסה גנטית בצמחים ובעלי חייםיצירת חיות מודל למחקר יצירת זני צמחים חדשים בשיטות גנטיות תרביות רקמה שיבוט בעלי חיים – עבר ,הווה ועתיד מעבדה בהנדסה גנטית – ישום חלקי של החומר הנלמד. ספרות עזר )MBC, ch.III-7. (Methods )MCB, ch. 7. (Recombinant DNA and Genomics הגדרה – הנדסה גנטית • העובדה העומדת בבסיס ההנדסה הגנטית היא :קיום האפשרות להעביר גנים מאורגניזם אחד למשנהו וע"י כך לשנות את התנהגותו של האורגניזם "המושתל". • תהליך של שינוי גנים של יצורים חיים ,ובכך שינוי תכונותיהם • רק בשנות ה 70-של המאה העשרים פותחו שיטות שאפשרו לבצע הנדסה גנטית. לשם מה הנדסה גנטית? ביוטכנולוגיה – שיפור תהליכי ייצור (ייצור מסחרי של חלבונים נדירים לרוב תרופות – אינסולין ). לשם מה הנדסה גנטית? השבחת גידולים חקלאיים ע"י הוספת גן לדנ"א שלהם. לשם מה הנדסה גנטית? השבחת בעלי חיים ע"י הוספת גן לדנ"א שלהם. לשם מה הנדסה גנטית? שינוי מיקרואורגניזמים לשם מה הנדסה גנטית? ריפוי גני (תיקון גנים פגועים במחלות בבני אדם). יישום • גן מחיידקים המוחדר לצמחים עלמנת לייצר קוטל חרקים "טבעי". • גן לאינסולין הומני מוחדר לצמחים לשם ייצור המוני. • כותנה כחולה לייצור מכנסים בלי צורך בצביעת הבד • תותים שהחדירו לתוכם גן מתוך דג הסנדל ,מגן מפני טמפרטורות קרות. • פיתוח זני פרחים בעלי צבעים ודוגמאות ייחודיות • עזים שמייצרות חלב שמכיל אנזים אנושי ,חיוני להצלת חיי אדם • מזון/צמחי )Genetic Engineering Modified (GEM – בארץ נעשים ניסויים רבים בהנדסה גנטית בצמחים ,לא מגדלים אותם מסחרית. – השוק הארופי אוסר על הכנסת זנים GEM האורז המוזהב • החדרת גן באורז היוצר פרו-ויטמין ( Aבטא-קרוטין) -וויטמין חיוני להתפתחות וגדילה ולבניית פיגמנט הראייה. • את הפטנט על "האורז המוזהב" מציעים המדענים חינם לממשלות דרום-מזרח אסיה ,השוק הגדול בעולם של אורז2.5 . מיליארד בני אדם שמזונם הבסיסי הזה (אורז לבן בעיקר) חסר בטה-קרוטן ומסיבה זאת ראייתם של מיליוני ילדים בעייתית ,עד כדי סכנת עיוורון" .האורז המוזהב" יכול להצילם שיטות בהנדסה גנטית 11 10שיטות בסיסיות בהנדסה גנטית – -1הגברה ושיכפול של מולקולות DNAע"י PCR – Polymerase Chain Reaction -2הגברה ושיכפול של מולקולות RNAע"י RT-PCR – Revearse Transcriptase -3יצירת cDNAמתעתיקי – RNAשימושים -4אנזימי הגבלה ( -)restriction enzymesעקרונות ושימושים. -5שיבוט ( - )cloningהחדרת מקטע DNAזר לתוך רצף-נשא/וקטור (פלסמיד ,או וירוס) -6הספגה Western, Northern, Southern Blot- -7ראקצית ריצוף – sequensingבדיקת רצף של חומצות גרעין. ראשית כל נלמד איך מפקים DNA הפקת דנ"א : • מקור • מטרה • תהליך ההפקה מקורות דנ"א אפשריים • דם • זרע • רוק • שתן • שיער • שיניים • עצם • רקמה למה משמש אותנו הדנ"א שהופק? • ( DNA fingerprintזיהוי ,בדיקת יחסים) • זיהוי שינוי גנטי (מוטציה) • מחקר בידוד גן השיטות בבסיס ההנדסה גנטית שימוש באנזימי הגבלה ,המאפשרים חיתוך של הדנ"א באתרים מוגדרים. שיבוט מולקולרי ,המאפשר יצירת עותקים זהים רבים של מקטעי הדנ"א שבודדו. קביעת סדר הנוקליאוטידים המאפשר קריאה אוטומטית של הרצף במקטעי הדנ"א שלב -1חיתוך הדנ"א בעזרת אנזימי הגבלה • בתהליך ההנדסה הגנטית יש לבודד את הגן שמעונינים להעביר ליצור אחר. • הקטע המבוקש הינו קטע זעיר במולקולת הדנ"א הגנומי. • השלב הראשון לאחר זיהוי הגן הרצוי הינו חיתוך מולקולת הדנ"א הגדולה למקטעים קצרים. • החיתוך נעשא בעזרת המספריים של הביולוגיה ,אנזימי ההגבלה. אנזימי ההגבלה מקורם ממיקרואורגניזמים ,הם אחד המנגנונים למניעת חדירת DNAזר לתא. התא מוגן מפני האנזימים של עצמו עקב בקרות עצמיות על האנזימים והגנות שונות על ה DNA -שלו. אנזימים אלו חותכים בין הנוקלואוטידים (הידרוליזה לקשרים הפוספודיאסטרים) המקום שבו חותך האנזים את הדנ"א נקרא אתר הגבלה. גילוי האנזימים הוביל לראשונה לחיתוך הדנ"א בצורה מבוקרת חוזרת ונשנית. מאפייני אנזימי ההגבלה • אתר זיהוי ספיציפי ( 8-4בסיסים ויותר). • אתר חיתוך ספיציפים • אתר הזיהוי ואתר החיתוך יכולים להיות רחוקים קרובים או זהים (אותו אתר). • ספיציפים ל – ssDNA, dsDNAאו לשנהם. • ספיציפים ל – dsRNA, ssRNAאו לשנהם. • יש כאלו שלא מבדלים בין DNAל.RNA - • חלקם חותך באמצע הגדיל ( )endonucleaseומשאיר קצה ישר או קצה לא ישר. • חלקם דורש קצה חופשי '3או .)exonuclease( '5 • ועוד ועוד................................. BamHI Ecor I Hind III השיטות בבסיס ההנדסה גנטית שימוש באנזימי הגבלה ,המאפשרים חיתוך של הדנ"א באתרים מוגדרים. שיבוט מולקולרי ,המאפשר יצירת עותקים זהים רבים של מקטעי הדנ"א שבודדו. קביעת סדר הנוקליאוטידים המאפשר קריאה אוטומטית של הרצף במקטעי הדנ"א שלב חיוני בהנדסה גנטית הוא יצירת עותקים רבים של הגן שרוצים להעביר בין אורגניזמים. • שיבוט בעזרת פלסמידים • שיבוט בעזרת נגיפים • PCR הגדרה -שיבוט שיבוט הינו תהליך בו נוצרים עותקים רבים זהים של דבר מה. בביולוגיה המונח מתיחס ל- .1יצירת עותקים רבים של מקטע )DNA (Molecular Cloning .2יצירת תאים רבים ()Cell Cloning .3יצירת אורגניזמים PCR – Polymerase Chain Reaction בעזרתDNA שיבוט מקטע Polymerase Chain Reaction• 1983 •קרי מוליס •השיטה מבוססת על תהליך בתאDNA-השכפול של ה שיבוט מקטע DNAבעזרת PCR – Polymerase Chain Reaction PCRהינה שיטה שמאפשרת לנו לעשות הגברה לאזור ספציפי ב . DNAאזור זה נמצא בין שני אזורים על ה DNAידועים מראש . עקרונות ה : PCR ישנם שלושה תהליכים בסיסים ב PCRשחוזרים על עצם בכל מחזור Denaturation at 94°C -1 במהלך הדנטורציה נפתחים הקשרים בין שני הגדילים ומקבלים שני גדילי דנ"א Annealing at 58°C -2 על מנת לאפשר קשירה ספיציפית של הפרימירים לגדילי הדנ"א extension at 72°C -3 זו היא הטמפרטורה האופטימאלית לפעולת הדנ"א פולימיראז שיבוט מקטע DNAבעזרת PCR – Polymerase Chain Reaction מערכת הראקציה ל PCR -מכילה: אנזים - Taq polymeraseזהו אנזים DNAפולימראז ,המסנטז בין 150-15נוקלאוטידים בשנייה -Taq polymerase bufferבופר לפעילות ה - MgCl2 ,Taq polymerase -ה Mg -הוא קופקטור הדרוש לפעילות האנזים, פריימרים -אוליגונוקלאוטידים ,אשר עוברים היברדיזציה עם רצפים משלימים ב -DNAוקובעים נקודת התחלה וסיום. - dNTPתערובת של דאוקסינוקלאוטידים ( )G,C,A,Tשמשמשים בתהליך ההכפלה ,והם אבני הבניין לסינטזת ה,DNA- מים מזוקקים דגימת ה.DNA- שלבי הPCR- שלב ראשון הפרדות הגדילים 95c שלב שני הצמדות התחלים 55c- 45c שלב שלישי שכפול הקטע שבין התחלים 65c-72c שלבי הPCR- מחזור חדש 2 שלבי הPCR- מחזור חדש 68ביליון עותקים 35מחזורים שלב שלישי שלב שני שלב ראשון שכפול הקטע שבין התחלים 65c-72c הצמדות התחלים 55c- 45c הפרדות הגדילים 95c שיבוט מקטע DNAבעזרת פלסמידים לייצירת ספריית גנים .1 חותכים את הגנום בעזרת אנזים הגבלה מתאים. .2 מפעילים את אנזים ההגבלה על פלסמיד עם אתר פעולה יחיד המוכר ע"י האנזים. הפלסמיד יישבר ויווצרו שני קצוות דביקים. .3 בנוכחות האנזים ליגאז יווצר חיבור בין הקצוות הדביקים של הפלסמיד לבין הדנ"א מהמקור הזר. .4 את הנשאים הרקומביננטים מחדירים לחיידקים בעזרת טרנפורמציה. .5 כל חיידק מהווה מקור למושבה שמכילה עותקים זהים של הגן הייחודי .6 כל מושבת חיידקים כזו היא ספר ונקראת "שבט" אוסף השבטים מהווה את ספריית הגנום. .7 בפועל הספרייה נראית כסדרה של צלחות המונחות על מדף במקרר. .8 מתוך הספרייה ניתן לשלוף שבט אחד או יותר המכילים את הגן המבוקש. שיבוט מקטע DNAבעזרת פלסמידים לייצירת ספריית גנים החדרת הגן המהונדס לתא המאכסן -טרנספורמציה • תהליך הקליטה של דנ"א לתא חי וביטויו בתא נקרא טרנספורמציה. • בטבע מתרחשת הטרנספורמציה בתדירות נמוכה ביותר ,אולם במעבדה ניתן להכשיר תאים לקליטת דנ"א באמצעות טיפול כימי ופיזיקלי. • הכנסת תאים של חיידקי E.coliלתמיסת מלח קרה כקרח , וחשיפתם להלם חום קצר בנוכחות דנ"א ,משפרת את כשרם של התאים לקלוט את הגן ,גם חשיפה להלם חשמלי משפרת את הקליטה זיהוי הגן המשובט בעזרת גן דווח •על מנת לזהות אם החיידקים קבלו את מקטע ה DNA -המוחדר ולא גדלו מושבות שלא נושאות את המחדר ניתן לתכנן גן דווח או גן לעמידות ביחד עם המחדר שלנו • גנים אלו ידווחו או יגרמו לסלקציה של החיידקים שנושאים את המחדר •לדוגמה :ביחד עם הגן שלנו נכניס גן שיבטא צבע פלורוסנטי או גן שמקנה עמידות לאנטיביוטיקה •כך ניתן לזהות את המושבה המבוקשת ,ומתוך החיידקים של אותה המושבה לבודד ולהפיק כמות גדולה של הגן המבוקש. זיהוי הגן המשובט איך זה נעשה? דוגמת האינסולין • היישום הראשון היה בתחום התרופות -הפיכת החיידקים לבתי חרושת. • לקראת סוף שנות השבעים של המאה העשרים החלו בייצור התרופה הראשונה- אינסולין ,בהנדסה גנטית. שיבוט חלבון האינסולין • חולי הסכרת שזקוקים להזרקה יומית של אינסולין לדמם, נעזרו עד אז באינסולין שהופק מבקר. התהליך היה יקר והכמות שהופקה הייתה מועטה ,כמו כן השוני בין אינסולין של אדם לשל חיות גרם לבעיות. התהליך שבוצע: – חוקרים בודדו את הגן לאינסולין וחתכו אותו מן הדנ"א האנושי ,בעזרת אנזימי הגבלה. – בנוסף לקחו פלסמיד של לאינסולין. E.coliוערבבו אותו עם הגן – ביטוי בחיידקים – הפקת החלבון וניקויו כיום יש תרופות רבות המיוצרות בשיטה זו ריצוף דנ"א ריצוף דנ"א sequensing ריצוף DNAהוא תהליך של קביעת סדר הנוקלאוטידים בקטע DNAנתון ,כלומר, מציאת רצף הDNA- לקביעת רצף יש מספר מטרות. .1 לוודא שהגן שהחדרנו לפלסמיד לצורך שיבוט הוא גן תקין ללא מוטציות .2 לאיתור מוטציות הגורמות למחלות תורשתיות .3 קביעת רצף ה DNA -של אורגניזם מסויים. ריצוף דנ"א sequensing ריצוף בשיטת Sanger בשיטה זו משתמשים בפריימרים (תחלים) המתאימים לרצף DNAהצמוד לקטע אותו רוצים לרצף ,ובאנזים דנ"א-פולימראז ,המשמש להארכת הפריימר ליצירת רצף משלים לקטע ה.DNA- בנוסף ,יש לספק לתגובה האנזימטית גם dNTPsמארבעת הסוגים ( A, T, Cו.)G- מבצעים 4תגובות מקבילות שלכל אחת מהן מספקים גם ddNTPאחד ( C, T, Aאו )G בו יש פוספט גם בעמדה ' 2בנוסף לעמדה ' .3שילוב של ddNTPברצף הDNA- המסונתז במבחנה יביא לעצירת הפולימריזציה .כך ,מתקבלים מגוון רצפים שנקטעו באורכים שונים. הרצת תוצרי התגובות האנזימטיות בגל אגרוז בעל יכולת הפרדה של נוקלאוטיד אחד מספקת את הרצף .בכל מבחנה יהיו תוצרים שאורכם הוא המרחק מהתחל ועד הבסיס/הנוקלאוטיד המסוים שהוסף לאותה תגובה בתור .ddNTP כיום נהוג להישתמש במערכות אוטומטיות וב ddNTPs-פלואורסנטיים .מערכות אלה יכולות להשתמש ב 4-חומרים פלואורסנטיים שונים ,דבר המאפשר הרצת כל הריאקציות על אותו גל והפרדה בין ה ddNTPs-השונים על פי הפלואורסנציה שלהם. ריצוף בשיטת Sanger בריא :הומוזיגוט לאלל התקין הטרוזיגוט למוטציה חולה :הומוזיגוט למוטציה (RT-PCR)reverse transcription polymerase chain reaction זהו תהליך שבו מקבלים DNAמ DNA ,mRNA -זה נקרא DNAמשלים ( )cDNA בגלל ש DNA -זה משלים את ה mRNA -הבוגר ה DNA -המתקבל כולל את האזור המבני בלבד ,ללא אזור בקרה ,וכן מכילים את הרצף המקודד בלבד ,ללא אינטרונים. RNAהיא מולקולה לא יציבה שמתפרקת בקלות (RT-PCR)reverse transcription polymerase chain reaction ספרייה גנומית ( cDNAהכנת DNAמ)mRNA - ספריה זו מקורה ב mRNA-המופק מרקמה כלשהי בגוף האורגניזם ,ש"תועתקה במהופך", ל ,DNA-באמצעות האנזים "( Reverse Transcriptaseמשעתק במהופך") .מקטעי ה- DNAשמתקבלים מוחדרים לחיידקים ויוצרים ספריית גנים. בספריה זו ,בניגוד לספריה הגנומית ,הגנים כוללים את האזור המבני בלבד ,ללא אזור בקרה ,וכן מכילים את הרצף המקודד בלבד ,ללא אינטרונים. ולכן היא מייצגת את הגנים המתבטאים ברקמה מסוימת בלבד אלקטרופורזה והספגה של DNAו RNA אלקטרופורזה אלקטרופורזה (באנגלית ): Electrophoresisהיא שיטה המאפשרת הפרדת חומרים המצויים בתערובת לפי הגודל .זוהי אחת השיטות המדעיות הנפוצות ביותר. באלקטרופורזה מונחת התערובת על גבי משטח העשוי ג'ל המשמש רשת תלת מימדית. זרם חשמלי מועבר דרך הג'ל ,כך שצידו האחד טעון חיובית והשני -שלילית .המולקולות בתערובת ,אשר טעונות חשמלית ,נודדות באיטיות לעבר קצהו האחד של הג'ל ,כשהן נשמעות לכוח המשיכה החשמלית .מרחק הנדידה תלוי בגודל המולקולה .ככל שהמולקולה גדולה יותר היא עובר מרחק קטן יותר בגל וככל שהיא קטנה יותר היא עוברת מרחק גדול יותר. אלקטרופורזה לפני הרצת DNAבג'ל ,חותכים אותו ע"י אנזימי הגבלה DNAמולקולה טעונה במטען שלילי ולכך הוא רץ לכיוון החיובי. פרופיל דנ"א ()DNA profile; DNA fingerprint דגם ייחודי של מקטעי דנ"א שמתקבל לאחר חיתוך הדנ"א באנזים חיתוך. אתרי החיתוך נמצאים במקומות שונים אצל האנשים השונים בגלל שוני בבסיסים. הפרופיל הגנטי משמש לזיהוי פרטים. דוגמה :אנזים שחותך בין AוC - 1- AAAAAAAAAAAAAAAAA 2- AAAAAAAACAAAAAAAA 3- AAAACAAACAAAAAAAA 4- AAACAAACAAACAAAC דוגמה לשימוש באלקטרופורזה של DNAלזיהוי חשוד באונס Southern blot -DNA הספגה של Northern blot -RNA הספגה של