Transcript 1-2-3
ביולוגיה מולקולרית והנדסה גנטית מבנה הקורס: בכל שבוע תינתנה 2שעות פרונטליות ולאחריהן שעת תרגול שמטרתה להעמיק את הידע הנדרש בשיטות מולקולריות נפוצות. דרישות הקורס: הגשת 3מטלות במהלך הסמסטר ,מעבדה בהנדסה גנטית (מפגש אחד)- השתתפות והגשת דוח מעבדה חובה ,מבחן סוף סמסטר המבוסס על חומר קריאה והרצאות. מבנה הציון: מטלות במהלך הסמסטר – חובת הגשה בלבד מבחן סוף סמסטר – 100%ציון [email protected] [email protected] • http://bioweb.wku.edu/courses/Biol22000 • http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc471/pages/ClipArt-molecules.html • http://genetics.nbii.gov/basic2.html • http://ory.ph.biu.ac.il/~snunit/library/mulg.shtml בעברית אתרי אנימציה • http://www.dnalc.org/shockwave • http://academy.d20.co.edu/kadets/lundberg/animations.html • http://vcell.ndsu.nodak.edu/~christjo/vcell/animationSite/transcription/movie. • שיעור - 1תוכנית מבוא : מהי ביולוגיה מולקולרית ובמה היא עוסקת מהי הנדסה גנטית מהם השימושיים המעשיים בשיטות אלו הכרת מושגי יסוד : מבנה ואירגון ה.DNA :- מבנה הכרומטין ,נוקלאוזומים והיסטונים. בסיסי ה DNA-וכיווניות הגדילים. שיעור - 1תוכנית הכפלת הDNA - תהליך ההכפלה הסמי-קונסרבטיבי של ה,DNA- הגדיל המוביל והגדיל הנסוג. האנזימים המעורבים בתהליך ההכפלה הגדרה – ביולוגיה מולקולרית • ביולוגיה מולקולרית עוסקת בעיקר באינטראקציה בין מערכות שונות של התא ,כולל הקשרים בין הדנ"א ,הרנ"א והסינתזה של החלבונים ,והבנה כיצד קשרים אלה מבוקרים – שכפול ,שעתוק ותרגום של החומר התורשתי . הגדרה – ביואינפורמטיקה • ביואינפורמטיקה והביולוגיה החישובית – סידור המידע השאוב מניסויים ביולוגים. – מיישמת כלים מתחום מדעי המחשב ,המתמטיקה, הסטטיסטיקה תורת המידע לשם עיבוד מידע ביולוגי רחב היקף. – כלים אלה כוללים מודלים מתמטיים ,אלגוריתמים ותוכניות מחשב ,שמתאפיינים בהתמודדות עם מאגרי מידע גדולים, בעיות בסיבוכיות גבוהה ,וחיפוש אחר תבניות. הגדרה – הנדסה גנטית • העובדה העומדת בבסיס ההנדסה הגנטית היא :קיום האפשרות להעביר גנים מאורגניזם אחד למשנהו וע"י כך לשנות את התנהגותו של האורגניזם "המושתל". • תהליך של שינוי גנים של יצורים חיים ,ובכך שינוי תכונותיהם • רק בשנות ה 70-של המאה העשרים פותחו שיטות שאפשרו לבצע הנדסה גנטית. לשם מה הנדסה גנטית? ביוטכנולוגיה – שיפור תהליכי ייצור (ייצור מסחרי של חלבונים נדירים לרוב תרופות – אינסולין ). לשם מה הנדסה גנטית? השבחת גידולים חקלאיים ע"י הוספת גן לדנ"א שלהם. לשם מה הנדסה גנטית? השבחת בעלי חיים ע"י הוספת גן לדנ"א שלהם. לשם מה הנדסה גנטית? שינוי מיקרואורגניזמים לשם מה הנדסה גנטית? ריפוי גני (תיקון גנים פגועים במחלות בבני אדם). יישום • גן מחיידקים המוחדר לצמחים עלמנת לייצר קוטל חרקים "טבעי". • גן לאינסולין הומני מוחדר לצמחים לשם ייצור המוני. • כותנה כחולה לייצור מכנסים בלי צורך בצביעת הבד • תותים שהחדירו לתוכם גן מתוך דג הסנדל ,מגן מפני טמפרטורות קרות. • פיתוח זני פרחים בעלי צבעים ודוגמאות ייחודיות • עזים שמייצרות חלב שמכיל אנזים אנושי ,חיוני להצלת חיי אדם • מזון/צמחי )Genetic Engineering Modified (GEM – בארץ נעשים ניסויים רבים בהנדסה גנטית בצמחים ,לא מגדלים אותם מסחרית. – השוק הארופי אוסר על הכנסת זנים GEM האורז המוזהב • החדרת גן באורז היוצר פרו-ויטמין ( Aבטא-קרוטין) -וויטמין חיוני להתפתחות וגדילה ולבניית פיגמנט הראייה. • את הפטנט על "האורז המוזהב" מציעים המדענים חינם לממשלות דרום-מזרח אסיה ,השוק הגדול בעולם של אורז 2.5 .מיליארד בני אדם שמזונם הבסיסי הזה (אורז לבן בעיקר) חסר בטה- קרוטן ומסיבה זאת ראייתם של מיליוני ילדים בעייתית ,עד כדי סכנת עיוורון" .האורז המוזהב" יכול להצילם מבנה התא גרעין מיטוכונדריה ממברנה ציטופלזמה הדנ"א נושא את המידע התורשתי ביצורים אאוקריוטיים רוב הדנ"א נמצא בגרעין התא. (1הכרת מושגי יסוד :מבנה הDNA - • כרומטין -ה DNA-יחד עם החלבונים הנלווים אליו (הנקראים היסטונים). • בנוסף להיסטונים ,קשורים אל ה DNA-חלבונים אחרים (חלקם אנזימים) בעלי תפקידים מגוונים. • הליפוף המיוחד של מולקולת ה DNA-סביב החלבונים מסביר את אריזתה הצפופה בצורה יוצאת מגדר הרגיל :אם נמתח מולקולת DNAהמרכיבה כרומוזום אחד ,אורכה יהיה כ 30-ס"מ ,גודלו של הכרומוזום ,לעומת זאת ,קטן ממיקרומטר (מיליונית המטר). חלבונים היסטונים: – חלבונים קטנים ובסיסיים מאוד .כתוצאה מהטעינה החיוביות הם מסוגלים לקשור באפיניות גבוהה את ה DNAהטעון שלילית. – ההיסטונים מאוד שמורים באבולוציה של אאוקריוטים ,מה שמעיד על העובדה שיש להם פונקציה שהשתמרה לאורך האבולוציה .לפיכך מוטציות בגנים שמקודדים להיסטונים הן קטלניות. – היסטונים מופיעים בכמות אדירה בתא ( 60מליון בתא) (לצורך הייחוס חלבוני רפליקציה מופיעות במספר בודד DNA ,פולימראז מופיע בערך 10,000בכל תא) • נוקלאוזומים – החרוזים ,וזו היחידה הבסיסית ביותר במבנה הכרומטין .מורכב מליבה היסטונית ומסיב .DNA • בשלב האינטרפאזה נמצא הכרומטין בתא באופן מפוזר .בעת חלוקת התא (מיטוזה או המיוזה) הכרומטין עובר כמה שלבי אריזה: • כל שלב דוחס את הכרומטין עד לכדי רמת דחיסה של פי .20,000-100,000 • הכרומטין קיים בשתי צורות: • אאוכרומטין :יחסית אינו צפוף; הגנים שארוזים בו יכולים ,לפיכך ,לעבור שעתוק, • הטרוכרומטין :מצופף מאוד; הגנים הארוזים בו בדרך כלל אינם מבוטאים. DNA- Deoxyribose Nucleic Acid .1 אבני הבניין של הדנ"א. .2 המבנה המרחבי של הדנ"א. .3 אריזת הדנ"א. .4 הכפלת הדנ"א. ה DNA-נושא את המידע התורשתי .1 ביצורים אאוקריוטיים רוב ה DNA-נמצא בגרעין התא. .2 ה DNA-הוא פולימר אשר היחידה הבסיסית היא נוקלאוטיד. .3 ה DNA-מורכב משני גדילים הקשורים בקשרי מימן. אבני הבניין של מולקולת הדנ"א הנוקלאוטיד בנוי משלושה רכיבים: בסיס חנקני סוכר בעל 5פחמנים (דאוקסיריבוז) זרחה. במולקולת הדנ"א יש 4סוגים של נוקלאוטידים. הם שונים זה מזה בבסיס החנקני .מסמנים כל בסיס באות הראשונה של שמו T G C A סליל הDNA - • אלפי נוקלאוטידים מתחברים בניהם ויוצרים שרשרת ארוכה. • שרשרת של נוקלאוטידים יוצרים גדיל אחד של מולקולת הדנ"א. • הנוקלאוטידים קשורים זה לזה בקשרים קוולנטים .הקשר נוצר בין הסוכר של נוקלאוטיד אחד לזרחה של הנוקלאוטיד הסמוך. הפוספט של נוקלאוטיד אחד נקשר לסוכר של הנוקלאוטיד הסמוך בפחמן '.3 כתוצאה מתקבל גדיל שבקצהו האחד יש נוקלאוטיד בו מצוי פחמן ' ,3והוא חופשי לקלוט עוד נוקלאוטיד .קצה זה נקרא קצה '.3 בקצה השני של הגדיל נמצא הפוספט ,המחובר לפחמן '.5 קצה זה נקרא קצה '.5 הסליל הכפול כל מולקולת דנ"א בנויה משני גדילים ,המצויים זה מול זה בכיוונים מנוגדים "ראש אל זנב". שני הגדילים מחוברים ביניהם באמצעות זוגות של בסיסים. הבסיסים החנקניים ,הבולטים משני הגדילים ,נקשרים ביניהם בקשרים מימניים. הסליל הכפול רק שני חיבורים אפשריים לקשר בין ארבעת זוגות הבסיסים: • אדנין נקשר רק עם תימין בשני קשרי מימן A • T גואנין נקשר רק עם ציטוזין בשלושה קשרי מימן. C G רצף הבסיסים בגדיל אחד קובע את רצף הבסיסים בגדילהאחר. שני גדילים הקשורים ביניהם נקראים גדילים משלימים (גדילים קומפלימנטריים). תזכורת -אז מה היה לנו -1מבוא : מהי ביולוגיה מולקולרית ובמה היא עוסקת מהי הנדסה גנטית מהם השימושיים המעשיים בשיטות אלו תזכורת -2הכרת מושגי יסוד : מבנה ואירגון ה.DNA :- מבנה הכרומטין ,נוקלאוזומים והיסטונים. תזכורת -2הכרת מושגי יסוד : בסיסי ה DNA-וכיווניות הגדילים. היום -3הכפלת הDNA - א -תהליך ההכפלה הסמי-קונסרבטיבי של ה ,DNA-הגדיל המוביל והגדיל הנסוג. ב -האנזימים המעורבים בתהליך ההכפלה מקורות עזר וקריאה The Cell, ch.I-3, (Fundamentals of Molecular Biology) The Cell, ch.I-4 (The Organization of Cellular Genomes) The Cell, ch.I-5 (Replication, Maintenance, and Rearrangements of Genomic DNA) הכפלת ה DNA- כיצד מתקבלות שתי מולקולות דנ"א זהות ממולקולה אחת ? • כאשר תא מתחלק ,מולקולת הדנ"א משכפלת את עצמה. • בתהליך השכפול ,כל אחד מזוג הגדילים משמש תבנית ליצירת גדיל חדש. • כל תא מתאי הבת מקבל מולקולת דנ"א עם מכלול גנטי שלם ,זהה לזה של תא האם. הכפלת ה DNA-היא סמי-קונסרבטיבית • כל דו-גדיל מורכב מגדיל הורה מקורי שעל גביו נבנה גדיל חדש על ידי התאמת בסיסים מתאימים .כך נוצרים שני דו-גדילים חדשים זהים אחד לשני ולמולקולה המקורית. • מסלסון וסטאל הוכיחו תיאוריה זו ע"י גידול חיידקים על בסיס חנקן כבד ולאחר מכן העברתם למדיום המכיל חנקן רגיל .בדור השני גילו צפיפות חנקן שהיא חצי מזו של החנקן הכבד במולקולות ובדור השלישי גילו היברידים בין הצפיפויות. סוגי ההכפלות אופן ההכפלה – שמרני ()Conservative שמרני למחצה ()Semiconservative מעורב ))Dispersive • הכפלה סמי-קונסרבטיבית (שמרנית למחצה) .אם נכניס בסיסים מסומנים ונבדוק את אופן ההכפלה במבחנה = אחרי סיבוב אחד של הכפלה בכל גדיל תהיה תערובת של גדיל אחד חדש (מסומן רדיואקטיבית) וגדיל אחד ישן . הכפלת ה – : DNAאנזימים מעורבים • • • • • טופואיזומרזות Topoisomerase – פותחות את מתח הגדיל הליקאזות Helicase – שומרות על פתיחת הגדילים דנ"א פולימראזות DNApolymerase – מסנטזות את הגדיל המוביל רנ"א פרימזות ()Primase – יוצרות פריימרים של RNAלהתחלת הגדיל המוביל ולהתחלות הגדיל הנסוג דנ"א ליגאזות ()Ligase – מחברות את מקטעי ה DNA-שנוצרים תכונות של דנ"א פולימארז I מבצע את פילמור (יצירת) שני הגדילים החדשים של ה .DNA-למעשה זהו קומפלקס חלבוני בעל מספר תכונות - – פעילות אקסונוקלאז מכיון 3לכיוון ,)3' to 5’ exonuclease activity '( 5חיתוך הקשרים הפוספדיאסטרים מסופה של המולקולה ומעניקה לאנזים תכונה של "תיקון עצמי" ."Proofreadingכאשר מוכנס נוקלאוטיד לא נכון בתהליך השכפול ,האנזים יכול לחסל אותו – בדומה לתהליך עריכה בהקלדת מסמך. – פעילות אקסונוקלאז מכיון 5לכיוון ,)5' to 3’ exonuclease activity( 3חיתוך הקשרים הפוספודיאסטרים בכיוון הסינטזה .מעניק לאנזים יכולת לחסל את הפרימר בזמן ההכפלה. • כדי להתחיל שיכפול לאנזים דרוש קצה ‘ 3'-OHמכאן נגזר שצריך פריימר. השלבים בתהליך השכפול :השלב ראשון • שני הגדילים המפותלים ,שבונים את הסליל הכפול של מולקולת הדנ"א,מתיישרים. • אנזימים מיוחדים )(Topoisomerase "מיישרים" את המולקולה על ידי פיתול הגדילים בכיוון מנוגד לכיוון הפיתול הרגיל. השלב השני • לאחר היישור ,שני הגדילים נפרדים זה מזה ,כמו רוכסן שנפתח. • האנזים הליקאז "פורם" את הגדילים; הוא גורם לניתוק קשרי המימן בין הגדילים. • אזור ההיפרדות דומה בצורתו לאות Y והוא נקרא מזלג השכפול. • מזלג השכפול מתקדם כל עוד נמשכת פתיחת הגדילים. • בתהליך השכפול יכולים להיווצר כמה מזלגות שכפול ,לפי מספר אזורי הדנ"א שמכפילים את עצמם. השלב השלישי • לאחר ההפרדה ,משמש כל גדיל תבנית ,אשר לפיה נבנה הגדיל החדש. • לאחר פתיחת הגדילים ,מופיע בתא אנזים אחר( )Primaseש"בונה" קטע קצר של נוקלאוטידים על גדיל אחד של דנ"א ,המשמש לו כתבנית. • הקטע הזה מכיל כ 10 -נוקלאוטידים והוא נקרא פריימר רק לאחר בנייתו של הפריימר ,מתחיל הדנ"א פולימראז בעבודתו. השלב השלישי • האנזים שבונה את שני הגדילים החדשים נקרא דנ"א פולימראז ,זהו האנזים העיקרי שפועל בתהליך השכפול. • הפולימראז "מטייל" לאורך הגדיל הישן ,ו"קורא" את רצף הבסיסים שלו .הוא "לוקח" מתוך מאגר הנוקלאוטידים ,המצויים באופן חופשי בגרעין התא ,את הנוקלאוטידים המתאימים ,ומחבר אותם לגדיל המקורי ,עד שמתקבל גדיל שני חדש. השלב השלישי בפעולתו של הפולימראז יש מס' "בעיות": .1 האנזים דנ"א פולימראז "יודע" לבנות את שרשרת הדנ"א רק בכיוון של ' 5ל- ' ,3ואילו במולקולת הדנ"א הגדילים מחוברים זה לזה בכיוונים מנוגדים ("ראש אל זנב"). .2 האנזים דנ"א פולימראז אינו מסוגל להתחיל בבניית גדיל חדש ,אלא רק להאריך גדיל קיים. כיצד מתבצעת ההכפלה של הגדיל שכיוון הנוקלאוטידים שבו הוא ' 3ל ?? 5 ' - • הגדיל שכיוון התארכותו ' 3ל 5' -נבנה מחיבור של קטעים קצרים של דנ"א הנקראים "פיסות אוקזאקי". • כל אחד מן הקטעים האלה נבנה בכיוון ' 5ל ,3'-והאנזים המכונה ליגאז ,מחבר אותם. על גבי הגדיל שכיוונו ' 3ל 5'-נבנה הגדיל המשלים ברצף ,ועל גבי הגדיל שכיוונו ' 5ל- ' ,3נבנה הגדיל המשלים מחלקי דנ"א ,שמתחברים ביניהם לגדיל רציף. • בתהליך שכפול הדנ"א נוצרים כמה פריימרים: – פריימר אחד על גבי הגדיל שכיוונו מקצה ' 3לקצה '5 – כמה פריימרים על הגדיל הנגדי ,שנבנה מפיסות אוקזאקי( ,לכל פיסת אוקזאקי -פריימר אחד). • לאחר בניית הגדיל החדש או לאחר בניית קטעי הגדילים החדשים ,ניתק הקשר שבין הפריימרים לדנ"א ובמקומו נוצר קשר בין רצפי דנ"א משלימים מתאימים. בסופו של תהליך השכפול ,מתקבלות שתי מולקולות של דנ"א דו-גדיליות; כל מולקולה מורכבת מגדיל אחד מקורי ומגדיל אחד חדש. כיוון יצירת הגדיל הכפלה בפרוקריוטים • לדוגמא -גנום של E. coliמכיל 4.7 x 10e6זוגות בסיסים • DNAשל פרוקריוטים הוא מעגלי • התחלת השכפול מתרחשת באזורים ספציפיים על ה- DNAהנקראים Origins of Replication :או בקיצור (.)ORIs • בפרוקריוטים אתר שכפול אחד ויחיד בגודל כמה עשרות זוגות בסיסים ,אלו אזורים עם low melting pointכי יש בהם הרבה זוגות של Aו ( Tשהקשר בינהם חלש יותר) וכך מתאפשרת נגישות של האנזים. • קצב השכפול הוא בערך 100קילובייס לדקה(לכן לוקח כ 40-דקות להכפיל) • רה-איניציאציה – רק בפרוקריוטים ,היכולת להתחיל שכפול נוסף של הכרומוזום המעגלי עוד לפני שנגמר השכפול הקודם ,וכך מתקדמים מספר שכפולים במקביל. – זמן דור של E.COLIהוא 20דקות ,בעוד זמן השכפול הוא 40דקות • DNAשל פרוקריוטים הוא מעגלי .האנזים DNAפולימראז עובד מהר יותר מDNA- פולימראז כי פחות חשובה לו האמינות ,כי הוא צריך להיות מסוגל לבטא חלבון במהירות וכן כי הוא עובד רק על גדיל אחד .השיכפול עשוי להיות דו-כיווני • בקרת השכפול היא בשלב ההתחלה -ברגע שנוצר המזלג ,השכפול מתקדם בקצב קבוע- בפרוקריוטים : • התקדמותו של מזלג ההכפלה יכולה להיות חד כיוונית או דו כיוונית או גם וגם ,מזלג דו-כיווני יעיל יותר ולכן נפוץ יותר .שני ניסויים שנערכו על מנת לקבוע אם נוצר מזלג חד או דו כיווני: הכפלה באאוקריוטים • באאוקריוטים גנום של אאוקריוטים הוא גדול בהרבה (כרומוזום מכיל כ – 150x10e6בסיסים) כדי לפצות על כך יש ORIsרבים במקומות שונים .מכל אתר כזה משתכפלת חתיכת כרומוזום בשם רפליקון .הרצף לא מוגדר • קצב השכפול נמוך בהרבה :בין 50-500בסיסים לדקה • כל 20עד kb 300נמצאת נקודת התחלה נוספת. • אם נתבונן במקטע המכיל אלפי ORIsיהיה תיאום ובבת אחת יתחיל שכפול מכולם. • קצב השכפול הכולל גדול יותר באאוקריוטים’ משום שיש הרבה יותר נקודות התחלה. • ברגע שנפתח ה DNA-ב origin-נקשרים אליו חלבונים ( (ORIGIN BINDING PROTEINSשמקבעים את המצב של ה DNAבתור חד גדילי .הם מגייסים את כל האנזימים הדרושים