半薄/超薄切片技术

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半薄/超薄切片技术
董
凤
2010-3
琴
背景:
分
辨
率
应
用
范
围
肉眼
光学显微镜
透射电镜
0.2mm
0.2µm
0.2nm
可观察 可观察细胞
头发丝、的结构
双面刀 (最大有效倍
刀刃的 数:1000)
厚度
观察半薄切片
可观察细胞内的
结构,分辨DNA、
蛋白质等生物大
分子、单个金属
原子(放大倍数可
达百万倍)
观察超薄切片
半薄切片
?
超薄切片
一、超薄切片技术介绍
超薄切片的基本要求:
固定地好
渗透包埋地好
切地好
载网膜做地好
染地好
超薄切片主要步骤
★取材
★固定
★漂洗、脱水
★渗透、包埋
★超薄切片
★超薄切片染色
每一步都是关
键,任何环节的
疏忽都会导致
制片的失败
1 取材
1.1 取材的基本要求
(1)动作迅速,取材后快速放入固定液中;
(2)体积要小,一般1㎜3,如果来不及,例如野外取
材,也可将组织修成(1×1×2)mm大小长条形,
之后再进行分割。
(3)减小损伤,切割器械锋利,操作轻,避免牵拉、
挫伤与挤压组织。
(4)低温操作,最好在低温(0℃~4℃)下进行,降低
酶的活性。所用器具和固定液都应预冷。
(5)取材部位要准确。
1.2 取材方法
材料放在洁净的韧性较大的纸上
滴上预冷的固定液
用刀片将组织切下并修小
用牙签或镊子将组织块移至盛有预冷
的固定液的小瓶中。
植物材料的取材可以先切成薄片,经适
当固定后再切成小方块继续固定。
2 固定 (抽气)
2.1 固定的目的
︾ 采用物理、化学等方法迅速杀死细胞的过
程称之为固定。
︾ 目的是尽可能使细胞中的各种细胞器以及
大分子结构保持生活状态,牢固地固定在
它们原来所在的位置上,不发生位移。
︾ 良好的固定是获得精细结构的形态学图象
的关键。
2.2 常用固定剂
(1)四氧化锇 (OsO4)-- OSMIUM TETRAOXIDE
※强氧化剂,与氮原子有较强的亲和力,可较好的固定脂肪、
蛋白质、磷酸脂蛋白;
※固定变性DNA及核蛋白,不能固定天然DNA、RNA及糖原;
※具有固定和电子染色双重作用,样品图象反差较好;
▼酶的钝化剂,不适合细胞化学的固定;
▼与乙醇/醛类反应生产沉淀--漂洗
●分子较大,渗透速度缓慢,但反应迅速,均匀固定深度0.25㎜;
●固定时间一般为1-2小时,时间太长易使组织变脆,切片困难;
●锇酸固定液常用浓度:1%-2%;
极易挥发,对粘膜、角膜毒性极大,操作要十分小心!
(2)戊二醛 ( C5H8O2)--glutaraldehyde
※有效保存组织细微结构,对蛋白质的固定效果好;
※渗透力强,渗透速度快,较好的固定糖原、核蛋白、微管、
内质网和细胞基质、有丝分裂的纺锤丝及胞饮小泡等;
※保存某些酶的活力,较好保存抗原,适于细胞化学研究;
※对组织和细胞的穿透力比四氧化锇强,均匀固定深
度:0.5~1mm ,0-4℃可长时间固定(几周甚至1~2个月)
不会使组织变脆,可用于远离实验室的取材;
▼缺点:不能保存脂肪,磷脂固定效果差,对细胞膜的显示
较差,没有电子染色作用。
(3)甲醛-Formaldehyde
※渗透组织的能力比戊二醛强,对于致密组织
(种子)固定作用好;
※细胞精细结构保存质量不如戊二醛,但酶活
性的保存优于戊二醛;
▼缺点:不能较好的固定细胞基质,脱水后大
部分细胞基质将丢失;
*常用多聚甲醛-戊二醛的混合固定液。
(4)高锰酸钾
※强氧化剂,较好固定脂蛋白;
※对神经髓鞘、叶绿体及其他各种膜结
构的研究均可作为固定剂;
※只用于某些常用固定剂难以固定的植
物和酵母样品,且一般不需要用锇酸
后固定.
3漂洗、脱水
3.1漂洗
漂洗的目的:
☆组织固定后脱水前的漂洗:
清除残留固定剂,减小固定剂和脱水剂之间
的反应,避免沉淀物干扰超微结构的观察.
☆双重固定中,在锇酸固定前的漂洗:
避免锇酸与戊二醛反应生成细小而致密的
饿沉淀,破坏细胞结构.
常 用
缓冲液
优 点
缺 点
磷酸盐
缓冲液
对细胞无毒性作用, 固定时易产生
缓冲能力强
沉淀,易长细菌
二甲砷
酸盐缓
冲液
不易长细菌,与低
浓度钙质1-3mM
不发生沉淀反应
醋酸-
巴比妥
缓冲液
易长细菌,只适
于配锇酸固定
固定时不产生沉淀
液,不适合配醛
类(缓冲失效)
有毒(通风橱)
pH
植物材
料一般
6.8~7.2
3.2 脱水
• 目的
将组织内的游离水彻底清除,保证
包埋介质完全渗入组织内部。
• 方法
用一种和水及包埋剂均能相混溶
的液体来取代水,常用的脱水剂是
乙醇和丙酮。
注意事项
• 脱水梯度逐级进行, 急剧脱水会引起细胞收
缩。( 30% →50%→70%→80%→95%→100%→100%);
• 更换溶液动作要快。长时间暴露空气中会
在组织内外产生微小气泡,影响渗透;
• 脱水过程中应在70%脱水剂中4℃停留或过
夜,过度脱水不仅引起更多物质的抽提,而
且会使样品发脆,造成切片困难;
• 置换用脱水剂:环氧丙烷(Epon812)、
二甲苯(石蜡)。
4 渗透和包埋、聚合
4.1渗透
渗透就是利用包埋剂渗入到组织内部
取代脱水剂的过程。
包埋剂在单体状态时(聚合前)为液体,
能够渗入组织内,当加入某些催化剂,
经加温或其他条件,能聚合成固体,
以便进行超薄切片。
4.2 包埋、聚合
包埋操作:
将组织块包埋在多孔橡胶包埋模板中
或胶囊中,一定条件下可聚合硬化,
形成包埋块。
包埋管
胶囊
1
包埋板
常用的包埋剂
◆环氧树脂(epoxy resin)
Epon812
吸潮性很强,
渗透效果好,切片的图像对比度强,潮湿和炎热的
电子束照射下稳定
环境下,树脂
会变软
Spurr
黏度低,可较好地渗透具有硬的木
质化细胞壁的植物细胞、脂肪含量 图像对比度较
很高的内胚乳、高度液泡化的成熟 弱
果实,电子束照射下稳定
Araldite
聚合均匀,收缩量很小,超薄切片
可直接沾在没有支持膜的载网上,
电子束照射下十分稳定,用重金属
染色时易着色。
◆水溶性树脂-丙烯酸类树脂
LR White、 Lowicryls、GMA、PEG 等,
适于进行组织化学和细胞化学研究的样品
制备。
适于低温包埋,通常用于免疫电镜样品的
制备。
包埋操作中的注意事项
§所有试剂要防潮,最好存放在干燥器中;
§所用器皿应烘干;
§配包埋剂时,每加入一种试剂要搅拌均匀;
§包埋时动作要轻巧,防止产生气泡;
§盛放过包埋剂的容器要及时用丙酮清洗干净.
§皮肤尽量不要接触包埋剂,以免引起皮炎;
5 超薄切片
5.1修块
削去表面的包埋剂,露出组织,然后在组
织的四周以和水平面成45度的角度削去包
埋剂,修成金字塔形,顶面修成梯形或长
方形,每边的长度为0.2mm~0.3mm。
5.2 超薄切片
超薄切片机:LEICA ULTRACUT R
超薄切片厚度:
<100nm,一般 50-70nm
5.3 载网和支持膜
(1)载网(超薄)
载网
铜网
(常用)
不锈钢网
镍网
(免疫电镜)
直径:2-3mm,厚度:0.03-0.02mm
5.3 载网和支持膜
(2) 载网支持膜
膜的要求:透明无结构,并能承受电子束的轰击.
支持膜的种类:
火棉胶膜
聚乙烯醇缩甲醛膜(formvar膜)
碳膜
膜的厚度:10nm~20nm
6 超薄切片的染色
目的:
增强样品的反差,提高图象的清晰度.
常用染色剂:
重金属盐
各种染料
▲超薄切片染色
常用的染色剂: 醋酸铀和柠檬酸铅。
染色方法:
(1) 组织块染色
在脱水至70%乙醇时,将组织块放在用
70%乙醇配制的饱和醋酸铀溶液中,染色
时间2小时以上,或在冰箱中过夜。
(2)超薄切片后染色
醋酸双氧铀-柠檬酸铅双染
铀染:细胞核及结缔组织染色
铅染:提高细胞质成分的反差
1)前固定(固定液体积是固定材料的十倍以上,材料不堆积)
3%戊二醛 in 0.1M PBS ,ph7.2,室温5-6h,后4°C保存
2)漂洗: 0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗3-4次,20-30Min/次
3)后固定
1%锇酸固定 in 0.1M PBS,4°C overnight
4)漂洗: 0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗3-4次,20-30Min/次
5)系列脱水:30%-50%-70%(4°C, overnight,可以停下)-80%95%-100%-100%)
用丙酮置换乙醇:
乙醇:丙酮=1:1,纯丙酮2次, 每级20-30分钟
6)渗透
丙酮:树脂=2:1, 1:1(可以停下了,overnight) ,1:2 2-3h/级
纯树脂12h,
换纯树脂12h (从进入树脂开始更要严格防潮!)
7)包埋聚合
60°C 24hr
注意:免疫电镜时不用锇酸固定,树脂换成LRWhite等水溶性树脂,固
定液可以是1.25%戊二醛+1.25%多聚甲醛 in 0.1M PBS Ph 7.2
超薄切片图片
二、半薄切片技术介绍
半薄切片主要步骤
★取材
★固定
★漂洗、脱水
★渗透、包埋
★半薄切片
★半薄切片染色
每一步都是关
键,任何环节的
疏忽都会导致
制片的失败
FAA固定液
(福尔马林5-冰醋酸5-70%酒精90)半薄/石蜡切片
※一般固定根、茎、叶、花药、子房组
织切片。
※幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精,
防止材料收缩;
※加入5%甘油可防固定液蒸发和材料变
硬。
卡诺固定液
纯酒精
1
2
15ml
30ml
氯仿
冰醋酸
5ml
5ml
1ml
渗透迅速,固定根尖和花药只需30-60分钟,
但固定时间不能太久,一般不超过一天
半薄切片
切片厚度:0.5~5um
切片捞到载玻片上
▲半薄切片染色
染色方法
现
象
番红-固绿对染法
木质化的细胞壁及细胞核-红
纤维素的细胞壁及细胞壁-绿
铁矾苏木精法
细胞一般结构及细胞分裂时期
的优良染剂,细胞分裂时期的
染色体染成黑色
高碘酸-席夫反应法 植物组织染成不同程度的红色,
可将纤维素细胞壁及淀粉粒染
(PAS法)
成红色
染料介绍
细胞壁的染料 酸性品红 番红 固绿 甲苯胺蓝
苏木精 结晶紫 亮绿 苏丹IV
细胞核染料
(碱性)
碱性品红 苏木精 洋红 番红 地
衣红 结晶紫
酸性品红 甲苯胺蓝 曙红 固绿
细胞质染料
(酸性)
苦味酸
各种荧光染料
染色原则:先用碱性染料染再用酸性染料染
半薄切片:免疫荧光
(LRWhite包埋)
半薄切片图片
三、刀具介绍
玻璃刀
钻石刀
超薄切片机
型号:LEICA ULTRACUT R
谢谢!