Transcript 半薄/超薄切片技术
半薄/超薄切片技术 董 凤 2010-3 琴 背景： 分 辨 率 应 用 范 围 肉眼 光学显微镜 透射电镜 0.2mm 0.2µm 0.2nm 可观察 可观察细胞 头发丝、的结构 双面刀 (最大有效倍 刀刃的 数:1000) 厚度 观察半薄切片 可观察细胞内的 结构,分辨DNA、 蛋白质等生物大 分子、单个金属 原子（放大倍数可 达百万倍） 观察超薄切片 半薄切片 ？ 超薄切片 一、超薄切片技术介绍 超薄切片的基本要求: 固定地好 渗透包埋地好 切地好 载网膜做地好 染地好 超薄切片主要步骤 ★取材 ★固定 ★漂洗、脱水 ★渗透、包埋 ★超薄切片 ★超薄切片染色 每一步都是关 键,任何环节的 疏忽都会导致 制片的失败 1 取材 1.1 取材的基本要求 (1)动作迅速，取材后快速放入固定液中； (2)体积要小，一般1㎜3，如果来不及，例如野外取 材，也可将组织修成（1×1×2）mm大小长条形， 之后再进行分割。 (3)减小损伤，切割器械锋利，操作轻，避免牵拉、 挫伤与挤压组织。 (4)低温操作，最好在低温(0℃～4℃)下进行，降低 酶的活性。所用器具和固定液都应预冷。 (5)取材部位要准确。 1.2 取材方法 材料放在洁净的韧性较大的纸上 滴上预冷的固定液 用刀片将组织切下并修小 用牙签或镊子将组织块移至盛有预冷 的固定液的小瓶中。 植物材料的取材可以先切成薄片，经适 当固定后再切成小方块继续固定。 2 固定 (抽气) 2.1 固定的目的 ︾ 采用物理、化学等方法迅速杀死细胞的过 程称之为固定。 ︾ 目的是尽可能使细胞中的各种细胞器以及 大分子结构保持生活状态，牢固地固定在 它们原来所在的位置上，不发生位移。 ︾ 良好的固定是获得精细结构的形态学图象 的关键。 2.2 常用固定剂 (1)四氧化锇 (OsO4)-- OSMIUM TETRAOXIDE ※强氧化剂，与氮原子有较强的亲和力，可较好的固定脂肪、 蛋白质、磷酸脂蛋白； ※固定变性DNA及核蛋白，不能固定天然DNA、RNA及糖原； ※具有固定和电子染色双重作用，样品图象反差较好； ▼酶的钝化剂，不适合细胞化学的固定； ▼与乙醇/醛类反应生产沉淀－－漂洗 ●分子较大,渗透速度缓慢,但反应迅速,均匀固定深度0.25㎜； ●固定时间一般为1-2小时,时间太长易使组织变脆,切片困难； ●锇酸固定液常用浓度：1％－2％; 极易挥发，对粘膜、角膜毒性极大,操作要十分小心! (2)戊二醛 ( C5H8O2)--glutaraldehyde ※有效保存组织细微结构,对蛋白质的固定效果好； ※渗透力强,渗透速度快,较好的固定糖原、核蛋白、微管、 内质网和细胞基质、有丝分裂的纺锤丝及胞饮小泡等； ※保存某些酶的活力,较好保存抗原,适于细胞化学研究； ※对组织和细胞的穿透力比四氧化锇强，均匀固定深 度:0.5~1mm ,0－4℃可长时间固定(几周甚至1～2个月) 不会使组织变脆，可用于远离实验室的取材; ▼缺点:不能保存脂肪，磷脂固定效果差，对细胞膜的显示 较差，没有电子染色作用。 (3)甲醛-Formaldehyde ※渗透组织的能力比戊二醛强，对于致密组织 （种子）固定作用好； ※细胞精细结构保存质量不如戊二醛，但酶活 性的保存优于戊二醛； ▼缺点：不能较好的固定细胞基质，脱水后大 部分细胞基质将丢失； ＊常用多聚甲醛－戊二醛的混合固定液。 (4)高锰酸钾 ※强氧化剂，较好固定脂蛋白; ※对神经髓鞘、叶绿体及其他各种膜结 构的研究均可作为固定剂； ※只用于某些常用固定剂难以固定的植 物和酵母样品，且一般不需要用锇酸 后固定. 3漂洗、脱水 3.1漂洗 漂洗的目的: ☆组织固定后脱水前的漂洗: 清除残留固定剂,减小固定剂和脱水剂之间 的反应，避免沉淀物干扰超微结构的观察. ☆双重固定中,在锇酸固定前的漂洗: 避免锇酸与戊二醛反应生成细小而致密的 饿沉淀，破坏细胞结构. 常 用 缓冲液 优 点 缺 点 磷酸盐 缓冲液 对细胞无毒性作用, 固定时易产生 缓冲能力强 沉淀,易长细菌 二甲砷 酸盐缓 冲液 不易长细菌,与低 浓度钙质1-3mM 不发生沉淀反应 醋酸－ 巴比妥 缓冲液 易长细菌,只适 于配锇酸固定 固定时不产生沉淀 液,不适合配醛 类(缓冲失效) 有毒(通风橱) pH 植物材 料一般 6.8~7.2 3.2 脱水 • 目的 将组织内的游离水彻底清除,保证 包埋介质完全渗入组织内部。 • 方法 用一种和水及包埋剂均能相混溶 的液体来取代水,常用的脱水剂是 乙醇和丙酮。 注意事项 • 脱水梯度逐级进行, 急剧脱水会引起细胞收 缩。（ 30% →50%→70%→80%→95%→100%→100%）; • 更换溶液动作要快。长时间暴露空气中会 在组织内外产生微小气泡，影响渗透； • 脱水过程中应在70%脱水剂中4℃停留或过 夜,过度脱水不仅引起更多物质的抽提，而 且会使样品发脆，造成切片困难; • 置换用脱水剂：环氧丙烷（Epon812）、 二甲苯（石蜡）。 4 渗透和包埋、聚合 4.1渗透 渗透就是利用包埋剂渗入到组织内部 取代脱水剂的过程。 包埋剂在单体状态时(聚合前)为液体， 能够渗入组织内，当加入某些催化剂， 经加温或其他条件，能聚合成固体， 以便进行超薄切片。 4.2 包埋、聚合 包埋操作： 将组织块包埋在多孔橡胶包埋模板中 或胶囊中，一定条件下可聚合硬化， 形成包埋块。 包埋管 胶囊 1 包埋板 常用的包埋剂 ◆环氧树脂(epoxy resin) Epon812 吸潮性很强， 渗透效果好，切片的图像对比度强，潮湿和炎热的 电子束照射下稳定 环境下，树脂 会变软 Spurr 黏度低，可较好地渗透具有硬的木 质化细胞壁的植物细胞、脂肪含量 图像对比度较 很高的内胚乳、高度液泡化的成熟 弱 果实,电子束照射下稳定 Araldite 聚合均匀，收缩量很小，超薄切片 可直接沾在没有支持膜的载网上， 电子束照射下十分稳定，用重金属 染色时易着色。 ◆水溶性树脂－丙烯酸类树脂 LR White、 Lowicryls、GMA、PEG 等， 适于进行组织化学和细胞化学研究的样品 制备。 适于低温包埋，通常用于免疫电镜样品的 制备。 包埋操作中的注意事项 §所有试剂要防潮，最好存放在干燥器中； §所用器皿应烘干； §配包埋剂时，每加入一种试剂要搅拌均匀； §包埋时动作要轻巧，防止产生气泡； §盛放过包埋剂的容器要及时用丙酮清洗干净. §皮肤尽量不要接触包埋剂，以免引起皮炎； 5 超薄切片 5.1修块 削去表面的包埋剂，露出组织，然后在组 织的四周以和水平面成45度的角度削去包 埋剂，修成金字塔形，顶面修成梯形或长 方形，每边的长度为0.2mm～0.3mm。 5.2 超薄切片 超薄切片机：LEICA ULTRACUT R 超薄切片厚度: <100nm,一般 50-70nm 5.3 载网和支持膜 (1)载网(超薄) 载网 铜网 (常用) 不锈钢网 镍网 (免疫电镜) 直径：2-3mm，厚度：0.03-0.02mm 5.3 载网和支持膜 (2) 载网支持膜 膜的要求:透明无结构,并能承受电子束的轰击. 支持膜的种类: 火棉胶膜 聚乙烯醇缩甲醛膜(formvar膜) 碳膜 膜的厚度:10nm～20nm 6 超薄切片的染色 目的: 增强样品的反差,提高图象的清晰度. 常用染色剂: 重金属盐 各种染料 ▲超薄切片染色 常用的染色剂: 醋酸铀和柠檬酸铅。 染色方法： (1) 组织块染色 在脱水至70%乙醇时，将组织块放在用 70%乙醇配制的饱和醋酸铀溶液中，染色 时间2小时以上，或在冰箱中过夜。 (2)超薄切片后染色 醋酸双氧铀-柠檬酸铅双染 铀染:细胞核及结缔组织染色 铅染:提高细胞质成分的反差 1）前固定（固定液体积是固定材料的十倍以上，材料不堆积） 3%戊二醛 in 0.1M PBS ,ph7.2，室温5-6h，后4°C保存 2）漂洗： 0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗3-4次，20-30Min/次 3）后固定 1%锇酸固定 in 0.1M PBS，4°C overnight 4）漂洗： 0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗3-4次，20-30Min/次 5）系列脱水：30%-50%-70%（4°C, overnight,可以停下）-80%95%-100%-100%） 用丙酮置换乙醇： 乙醇:丙酮=1:1，纯丙酮2次， 每级20-30分钟 6）渗透 丙酮:树脂=2:1， 1:1（可以停下了，overnight） ，1:2 2-3h/级 纯树脂12h， 换纯树脂12h （从进入树脂开始更要严格防潮！） 7）包埋聚合 60°C 24hr 注意：免疫电镜时不用锇酸固定，树脂换成LRWhite等水溶性树脂，固 定液可以是1.25%戊二醛+1.25%多聚甲醛 in 0.1M PBS Ph 7.2 超薄切片图片 二、半薄切片技术介绍 半薄切片主要步骤 ★取材 ★固定 ★漂洗、脱水 ★渗透、包埋 ★半薄切片 ★半薄切片染色 每一步都是关 键,任何环节的 疏忽都会导致 制片的失败 FAA固定液 （福尔马林5-冰醋酸5-70%酒精90）半薄/石蜡切片 ※一般固定根、茎、叶、花药、子房组 织切片。 ※幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精， 防止材料收缩； ※加入5%甘油可防固定液蒸发和材料变 硬。 卡诺固定液 纯酒精 1 2 15ml 30ml 氯仿 冰醋酸 5ml 5ml 1ml 渗透迅速，固定根尖和花药只需30-60分钟， 但固定时间不能太久，一般不超过一天 半薄切片 切片厚度：0.5~5um 切片捞到载玻片上 ▲半薄切片染色 染色方法 现 象 番红－固绿对染法 木质化的细胞壁及细胞核－红 纤维素的细胞壁及细胞壁－绿 铁矾苏木精法 细胞一般结构及细胞分裂时期 的优良染剂，细胞分裂时期的 染色体染成黑色 高碘酸－席夫反应法 植物组织染成不同程度的红色， 可将纤维素细胞壁及淀粉粒染 （PAS法） 成红色 染料介绍 细胞壁的染料 酸性品红 番红 固绿 甲苯胺蓝 苏木精 结晶紫 亮绿 苏丹IV 细胞核染料 （碱性） 碱性品红 苏木精 洋红 番红 地 衣红 结晶紫 酸性品红 甲苯胺蓝 曙红 固绿 细胞质染料 （酸性） 苦味酸 各种荧光染料 染色原则：先用碱性染料染再用酸性染料染 半薄切片：免疫荧光 （LRWhite包埋） 半薄切片图片 三、刀具介绍 玻璃刀 钻石刀 超薄切片机 型号：LEICA ULTRACUT R 谢谢！