尼氏染色法观察小鼠海马中神 经元的生长情况

一、实验原理

  

（1）海马与学习记忆的关系：

学习记忆是大脑最基本也是最重要的高级神经功能 之一，是中枢神经系统功能的整合。学习：是指人 和动物获得关于外界信息的过程。记忆：是将获得 的信息进行储存和读出的过程。 多年来人们对学习与记忆在脑内的定位问题进行了 大量的研究，近年来不少学者认为边缘系统中的海 马（ hippocampus ）是学习、记忆等高级神经活动的 重要部位。 众多研究表明，损毁双侧海马动物的学习记忆能力 明显下降，对大鼠的分辨学习、防御条件反应的保 持及空间习得能力都有破坏。

学习记忆的神经机制 行为(学习记忆) 系统(神经系统) 组织(神经组织)

海马

细胞(神经细胞)

突 触

分子

LTP

海马的位置：

海马(hippocampus, Ammon horn)：位于 侧脑室下角底及内 侧壁，形状如海马， 全长约5cm，呈一条 镰状隆嵴。

海马的分区

: 海马与齿状回均属于古皮质3层结构:分子层、锥体 细胞层（海马）、颗粒细胞层（齿状回）。 2 始层 3 锥体层 4 放射层 1 室床 5 腔隙分子层 Sch Schaffer 侧枝 Mf 苔藓纤维 AP 室床通路 PP 穿通路 8 颗粒层 7 齿状回多形层 6 齿状回分子层   经颞叶中部做大脑半球的冠状切面，海马呈双重C环抱的外形，大C代表海马，开口 向腹内侧，小C代表齿状回，位于海马沟的背内侧，开口朝背侧。 依据细胞形态及皮质发育的差异，海马被分为CA1、CA2、CA3、CA4四个扇形区。

（2）神经元的尼氏体染色法：

 神经组织的基本成分主要由神经细胞和神经胶质细胞组成。 神经组织或细胞的染色在病理学诊断、科学研究和教学过 程中，都有非常重要的意义和使用价值。神经元作为神经 系统结构和功能的基本单位，如何应用适当的方法准确地 显示神经元，对观察神经元数目、形态、大小、分布以及 生存状况等显得非常重要。  在形态学上尼氏体是神经细胞的特征性结构，尼氏体 （Nissl body）又称虎斑,广泛存在于神经元的胞体和树突 内,具有嗜碱性的特点。

  由于尼氏小体具有嗜碱性的特点，1892年德国病理学 家F. Nissl（1860-1919）创立了尼氏染色法（Nissl staining），甲苯胺蓝为碱性染料，可将尼氏体染成 紫蓝色。 尼氏染色中尼氏体受染后呈块状(形如虎斑) 或颗粒状, 核周围尼氏体颗粒较大,近边缘处较小而细长。

甲苯胺蓝染色法结果：

尼氏体呈深蓝色颗粒或斑块状, 细胞核为蓝色, 染 色背景为淡蓝色。

尼氏体的生理功能：

 在电镜下观察，尼氏体主要由平行 排列的粗面内质网和核糖体组成， 其化学成分是核糖核酸和蛋白质。  尼氏体的主要功能是合成蛋白质， 作为神经活动时所需，如细胞中的 某些成分的更新以及产生神经递质 有关的蛋白质和酶类。轴突端的蛋 白质大都来自胞体的尼氏体。神经 元在兴奋传导过程中，不断消耗某 些蛋白质物质，尼氏体可合成新的 蛋白质以补充这种消耗。

 在正常生理情况下,各种神经元的尼氏小体皆有其特殊 的数量和特征性的形态分布，Nissl小体大而数量多， 说明神经细胞合成蛋白质的功能较强。  在病理状态下，当各种诱发因素导致神经元受损害变 性时，尼氏小体的变化甚为敏感，逐渐由块状或颗粒 状变成粉末状， Nissl小体的数量会减少甚至消失。 因此尼氏小体结构变化可作为神经元受损的标志。

二、实验目的

  1、了解海马的结构及其在学习记忆中的作用。 2、掌握小鼠经心脏灌流固定技术以及小鼠脑 组织分离方法。  3、掌握神经元尼氏染色法的原理和步骤。

三、实验材料

    用于尼氏染色的常用染料有：甲苯胺蓝 blue) 和焦油紫（ cresyl violet ） 。 (toluidine 所需试剂： 4% 多聚甲醛；生理盐水； 1 × PBS ；双 蒸水；甲苯胺蓝； 70% 、 80% 、 95% 、 100% 酒精； 二甲苯；中性树脂；明胶。 1% 甲苯胺蓝染色液 ：母液为甲苯胺蓝 1g ，无水乙醇 100ml 。使用时按 1:1 比例与新鲜的 0.1%NaCl 溶液混 合成工作液。 焦油紫 ：焦油紫 0.1g

；蒸馏水 99ml ； 1% 冰醋酸 1ml 。 染色缸、载玻片、盖玻片、切片机、手术器械、输 液管、光学显微镜、小毛刷、 24 孔板。

四、实验步骤

1、昆明小鼠以0.48%的戊巴比妥钠0.02ml/g腹腔注射麻醉， 待其麻醉后，迅速用手术剪刀及镊子剪开皮肤使其心脏 暴露，从心尖部插导管于左心室，并用动脉夹夹住，同 时剪开右心耳。 2、经心脏灌流和固定：先用生理盐水灌流（约30min）， 待流出液清亮后，再换成4%多聚甲醛固定液继续灌流， 直到小鼠肝脏变硬，尾巴僵硬为止（约2h）。 3、待充分固定后，剪下小鼠头部并开颅取脑，再浸入4% 多聚甲醛中进一步固定1d。

4、将脑组织用502胶水固定，在振荡切片机上进行冠 状位连续切片，厚度为25μm。 5、将切好的脑片浸于1%的明胶PBS液中中，用毛刷将 脑片贴到预先用明胶处理的载玻片上，然后自然 风干。 6、切片染色：将脑片置于 1%甲苯胺蓝染色液 或焦油紫 中50-60℃烘箱中染色30-40min。

7、切片用蒸馏水冲洗3次。 8、脱水：切片放入70%乙醇3min →80% 乙醇 3min→95% 乙醇 3min→100% 乙醇 Ⅰ 中 2min→100% 乙醇 Ⅱ 中 1min 。 9、透明：切片浸入二甲苯Ⅰ，Ⅱ中，各5min； 10、中性树胶封片，并盖上盖玻片。 11、显微镜下观察照相并对尼氏染色阳性神经元进 行计数。

五、注意事项

1、Nissl染色液的染色能力很强，并且染色后很难去除， 请注意勿使染色液沾染皮肤和衣物等。 2、二甲苯对眼及呼吸道有刺激作用，高浓度对中枢神经 有麻醉作用。因此，切片透明过程应该在通风橱中进 行。

六、思考题

1 、除了尼氏染色法以外，你知道还有哪些方法可以对 神经元进行特殊的染色，并详述其原理和步骤。 2、查阅相关文献，你认为神经细胞尼氏体染色方法可 以有哪些改良方法。 参考文献： [1]陈德英，程赛宇，肖燕.神经元尼氏染色法在坐骨神经损伤 研究中的应用.创伤外科杂志，2001，3：35-37.

[2]周君，陈勤.神经细胞尼氏体染色方法改良.生物学杂志， 2010,27（5）：94-95.