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第二章 医学电子显微学研究方法 第一节 TEM样品制备技术 细胞是生物体结构和功能单位，细胞小结构复杂无色透明， 若不借助适当的手段，难以观察，更难发现细胞内各种成份的 分子组成和功能，因此研究细胞的技术决定了我们对细胞的认 识。许多细胞生物学的重要进展及新概念的形成来自新技术的 应用。 在实际应用中电镜图像的分辨率，不仅取决于电镜本身的 分辨率,也取决于样品的结构和反差，而样品的结构和反差在很 大程度上受到样品制备技术的限制。电镜的分辨率在1.24Å ， 生物样品最佳制备仅能达到20－30Å ，这样远远不能发挥电镜 的高分辨性能，这种差距说明许多更小的结构细节还没有被人 们发现和认识。 超薄切片技术 Ultrathin Section Techniques 是TEM生物样 品制备中最基本的常规技术。它是通过一系列化学方法把组织 和细胞制备成树脂包埋块，这种包埋块应具备以下性能： 1、最大限度的保持组织和细胞在生活状态下的结构及形态， 保存抗原和酶的活性。 2、切片厚度在50－100nm，具有固定的形状。 3、透光度好，耐电子束轰击。 4、在TEM下树脂不成像，经过电子染色切片具有良好的反差 超薄切片技术是1948年 Pease 和 Barker 二位英国科学家 创立的，经过多年的不断发展和改进现已趋于完善。现将样品 制备程序归结如下： 超薄切片制备程序 Preparetion procecture of ultrathin section 取材 细切 预固定 冲洗 后固定 冲洗 脱水 浸透 包埋 聚合 修整 半薄切片 复红和次甲基蓝染色 包埋块 光 镜定位 超薄切片 电子染色 TEM观察 一、取材 Materail 从动植物机体上，细胞及微生物的培养物中，取得所需 材料的过程叫取材。由于生物材料在离开机体或正常的生长 环境后，其结构在自溶酶的作用下，容易发生死后变化。为 了保持生物材料的原生活状态，取材时应遵守以下原则 1、取材的要求 ⑴ 准确：根据研究的目的和要求，要准确的确定取材的位置 ⑵ 快速：为了保持生物材料的活体状态，取材速度要块，最 好在1－2分钟之内，将所取样品放入固定液中。 ⑶ 样品体积要小：由于固定液的渗透能力弱，四氧化锇的渗 透深度为0.25mm，戊二醛的渗透深度为0.5mm。为了保证固定 剂能均匀的渗入到样品内，一般要求样品体积不超过2mm³。 ⑷ 低温取材：细胞离体后，细胞内的各种水解酶释放到组织 中使构成组织的主要结构，蛋白质、核酸降解造成自溶，为了 降低酶的活性，要在0-4℃低温条件下取材保存。 样 品 取 材 示 意 图 ⑸ 防止损伤：取材前要作好准备工作，用铅笔写好标签。取 材器具要锋利，动作轻巧，防止挤压造成细胞的损伤。 2、取材的方法 材料来源于，实验动物、手术样品、血液、骨组织、培养 细胞和活检材料等。 ⑴ 实验动物材料：将动物用乙醚麻醉后处死，取出所需材料 切成长条状，粗细在1.0×1.0×3.0mm³放入固定液中固定30 分钟，然后细切成1－2mm³的小块继续固定2小时。4℃存放。 ⑵ 人体组织材料：包括病理活检和尸检材料，这种组织往往 带有血液和组织液成份，取材时用生理盐水反复冲洗后再固 定。尸检材料一般在低温下保存的组织，争取在死后3－12小 时内取材，最长不超过24小时，否则造成细胞膜结构的损伤。 ⑶ 体外培养细胞材料：对生长在培养瓶中的细胞，去掉培养 液，放入适量的固定液固定3－5分钟后用刮刀刮下贴壁细胞 离心，离心1500－3000转15分钟，使细胞沉淀聚团。 ⑷ 血液材料：取外周血3－5ml，放入加有抗凝剂的试管内， 1ml血加抗凝剂0.15ml，离心沉淀1500转15分钟至分层。血清 －血小板－白细胞－红细胞，根据所需材料，取不同的分层 液，然后加入新鲜的戊二醛离心固定。 抗凝剂的配制 柠檬酸纳 2g 柠檬酸 8g 葡萄糖 24.5g 双蒸水加至 1000ml ⑸、骨组织材料：骨组织比较坚硬，取材时组织块尽可能 小一些，放入固定液中固定后在放入脱钙剂中，根据不同 部位的骨组织，采用不同的脱钙时间。一般脱钙时间为1－ 3周，每周更换一次脱钙剂，待骨组织能被针刺进，即为钙 盐已经脱好，可以进行常规制样。 脱钙剂的配制 （PH7.2) EDTA 5g 0.2M磷酸缓冲液 50ml 蔗糖 6.84g 双蒸水加至 100ml ⑹ 需要定向取材的组织：例如，胃、肠、血管、气管、 食道和分层的组织，皮肤、角膜、子宫等在取材时需定位 切剪成条状，大小在 1.0×1.0×3.0mm³, 定位包埋。 二、固定 Fixation 用化学和物理的方法快速杀死细胞的过程叫作固定。 1、固定目的 在分子水平上把细胞可动的动态系统，转变成不可动的， 稳定的胶体，而且这种胶体接近于生活时的状态，使细胞的 微细结构完好无损。 2、固定剂的作用 ⑴ 能快速均匀进入细胞内，稳定细胞内各种化学成份。提供 细胞骨架作用。 ⑵ 能快速杀死细胞，与细胞内的大分子物质、蛋白质发生 化学结合形成交连， 使蛋白成份凝固，保存糖类和脂肪生 活 时的状态和位置。 ⑶ 避免有机溶剂对脂类物质的抽提，对细胞不产生收缩和膨 胀作用，不产生人工假象和变形。 ⑷ 保存酶的活性和抗原性。 3、固定剂的种类和特点 理想固定剂不但能完整的保存细胞微细结构，同时还具有 良好的电子反差，固定剂主要作用于蛋白质、脂肪和糖类。作 用原理尚不清楚，至今还没有一种全能的固定剂对物质很好固 定，各种固定剂对细胞成份的固定是有选择性的。电镜生物样 品采用双重固定法。常用固定剂有以下几种： ⑴、戊二醛 gluteraldehyde 戊二醛是一种五碳醛，含有二个醛基，对细胞微细结构有 很强的亲和力，其结构式为 O＝CH－CH2－CH2－CH2－CH＝O， 分子式为 C5H8O2。市售浓度为25%－50%水溶液，PH 4.5-5.0。 高温、中性或碱性PH均能使戊二醛发生聚合失去醛基，降低高 联效力。电镜生物样品常用戊二醛的浓度为2.5-3%，4℃保存 备用。 优点 A：和组织细胞反应迅速，渗透深度大0.5mm。 B：对蛋白质、糖原有较好的固定效果。 C：对细胞内膜性结构保存良好，例如：微管、ER、 Mit膜和细胞基质。 D：能较好的固定植物组织。 缺点 A：没有电子染色作用。单独用戊二醛固定的生物样 品电子反差不好，不能显示膜结构。 B：对脂肪保存效果不好。 戊二醛配制 2.5%戊二醛磷酸固定液（PH7.4） 0.1M磷酸缓冲液 50ml 25%戊二醛 12ml 双蒸水加至 100ml ⑵、四氧化锇 Osmiam tetroxide 四氧化锇俗称锇酸（OSO4），是一种淡黄色、具有强烈刺 激气味的晶体，为强氧化剂与氮原子有很强的亲和力。常用浓 度为1%，4℃保存。 优点 A：对蛋白质、氨基酸有非常好的固定作用，是唯一能 保存脂类的固定剂。 B：对样品有很强的电子染色作用，提高图象的反差。 缺点 A：对糖类、核酸保存作用差穿透能力弱， 反应缓慢。 不保存抗原和酶的活性，不能用于细胞化学。 B：剧毒，蒸发的气体对粘膜组织有损伤。 四氧化锇的配制 1%四氧化锇固定液 1%四氧化锇 1g 0.1M磷酸缓冲液 99ml 4、常用的固定方法 ⑴单固定法：对单个细胞，固定液易于渗透的组织，一般用1% 四氧化锇固定1－2小时即可。 ⑵双重固定法：用戊二醛预固定2小时，样呈淡黄色，然后在用 1%四氧化锇后固定1小时，样品呈黑色。戊二醛和四氧化锇之间 可以产生沉淀反应，所以要充分洗涤。 ⑶原位固定法：此法用于解剖关系复杂和对缺氧比较敏感的组 织，在保持器官血液供应的情况下，边解剖边将固定液滴加到 器官上使组变硬后在取材固定。 ⑷灌流固定法：用于脑垂体、甲状腺、甲状旁腺等血液供应丰 富的组织，通过血液循环的途径，将固定液灌注到组织中，待 组织硬化后取材作双重固定。 三、脱水 Dehydration 用适当的有机溶剂取代组织细胞中的游离水分。因为水 的存在会使组织细胞的结构在电镜高真空状态下急聚收缩而 破坏。常用的包埋剂是非水溶性的，细胞中游离水影响包埋 剂的浸透，造成切片和观察的困难。常用的脱水剂为丙酮， 为了防止样品的剧烈收缩，脱水采用梯度脱水法。 乙醇和丙酮 时间 温度 50 % 15分钟 4℃ 70 % 15分钟 4℃ 90 % 15分钟 4℃ 100 % 3次每次10分钟 室温 注意事项：脱水要彻底，时间和速度要适当。一般认为脱水 剂在70 % 时是组织变化最小的状态，可以延长时间。 四、浸透 Penetration 经过脱水处理的样品，需要用包埋剂浸透，其目的是用包 埋剂逐步取代样品中的脱水剂，使细胞的内外空隙都被包埋剂 充填。浸透时间最好为9－12小时，一般过夜后进行包埋。 五、包埋和聚合 Embeding and Polymeriztion 包埋是指样品内的脱水剂被包埋剂完全置换后将样品和包 埋剂放入药用胶囊内，在热作用下聚合成固体包埋块的过程。 ⑴、包埋剂的种类和配制 良好的包埋剂具有易溶于脱水剂，粘稠度低、聚合均匀、 耐电子束轰击、能良好的保存微细结构、高倍放大下不显示自 身结构。目前常用的包埋剂有二种 环氧树脂618：国产，为淡黄色粘稠度较大的液体，对组织损 伤较小，对细胞的微细结构尤其是膜结构保存 完好。粘稠度大，对组织浸透不均匀。 Epon812：进口，是国际上普遍使用的一种优良的包埋剂，为 淡黄色粘稠度低的树脂，渗入组织快均匀，价格 昂贵。 环氧树脂618配方 Epon812配方 环氧树脂618 5.0ml Epon812 13ml DDSA(硬化剂） 5.0ML DDSA 8ml MNA 7ml DMP-30 0.5ml 十二烷基琥铂酸酐 DBP (增塑剂〕 0.3ml 邻苯二甲酸二丁酯 DMP (催化剂） 二甲氨基甲基 0.5ml ⑵ 包埋方法 常规包埋法：把组织放入药用胶囊的顶端，放入实验标签，然 后加入包埋剂。 定向包埋法：根据材料的不同，定向取材及包埋。 包埋注意事项: 在包埋的过程中，避免水蒸气的进入，必须在 干燥的环境下工作。 各 种 包 埋 模 具 ⑶ 聚合 聚合方法：将放有组织块和树脂的胶囊，放入包埋模具中，烤 箱内聚合48小时。 温度 时间 37℃ 12小时 45℃ 12小时 60℃ 24小时 聚合的原理： 环氧树脂为热塑性树脂，它和一定的硬化剂、催化剂在温 度的作用下形成不可塑性黄色透明固体块，称为包埋块。DDSA 在树脂聚合中起到固化剂的作用，DMP－30加速了树脂的聚合， 为了改善包埋块的切割性DBP起到了增塑的作用。 六、包埋块的修整 将聚合好的包埋块，用70℃热水洗去胶囊，用修块机把组 织修成45℃角立体梯形。 包 埋 块 的 修 整 七、半薄切片 对于某些必须限定方向或部位的结构，如肌纤 维的断面、脑内的核团、病变的区域等，在进行超 薄切片前，需先进行半薄切片（1um)的厚片在光镜 下定位，才可以比较准确的选择超薄切片的部位， 避免盲目切片，提高电镜的观察效率。 半薄切片染色法： 次甲基蓝天青Ⅱ－碱性复红染色：细胞核、胶原和结 缔组织为蓝色，线粒体、髓鞘、细胞浆、平滑肌为红 色。 八、铜网和支持膜 coppergrid and support film TEM用金属载网和支持膜来支撑超薄切片的样品，常用 的金属载网有铜网和镍网，直径在2－3mm,网格为200目为宜。 大孔载网，电子束透过率高，支持性差，适用于低倍大视野观 察，小孔载网，电子束透过率低，支持性好，适用于高倍高分 辨观察。镍网适用于免疫电镜。 铜网的类型 ： 1－3 150目；4－6 180目；7 200目；8.9 单孔； 10－12多缝。 支持膜，由于生物样品对电子束轰击的耐受力较弱，所 以要在铜网上覆盖一层支持膜。支持膜本身没有结构，薄而 透明易被电子束穿透，有很强的机械强度，耐电子束轰击， 不和样品发生化学反应。厚度在150Ǻ。 1 formvar：化学名称是聚乙烯醇缩甲基，机械强度高。 2 火棉胶膜：机械强度弱，制作简单。 3 碳膜：机械性和化学性稳定性好，适合高分辨电镜用。 Formvar 膜 的 制 备 方 法 1、载玻片浸入Formvar溶液中 2、在水面上剥离Formvar膜 3、将载网置于Formvar膜上 九、超薄切片 Ultrathin Section 超薄切片是以厚度为单位进行的切片，制备超薄切片的 机器为超薄切片机，根据其工作原理分为热膨胀式和机械推 进式二种。切片的环境温度在18－25℃，湿度在60%以下，室 内要安静。切片厚度在500Ǻ。 切片质量的判定： ⑴ 厚度：暗灰色为400Ǻ以下；灰色为400－500Ǻ；银白色 为500－700Ǻ；金黄色为700－900Ǻ；紫色900Ǻ以 上，以灰色为宜。 ⑵ 切片无刀痕，无皱褶，无污染。 SUPER NOVA 超 薄 切 片 机 十、电子染色 positive staining ⑴ 电子染色的概念：电子染色又称阳性染色，与光镜组织标本 染色概念完全不同，它不是有以颜色来分辨组织结构的，而是 用重金属盐和细胞内的某些成份结合或吸附，在电子束的照射 下，样品形成不同的散射能力，而提高图像的反差，以达到染 色的目的。 ⑵ 电子染色的原理：细胞和重金属盐结合，细胞不同结构吸附 重金属原子数量的能力不同，结合较多的区域具有大的电子散 射能力，在电镜下电子反差强，结合少的或没有结合的区域电 镜下为透明区。通过电子染色提高图像的反差。 ⑶ 染色剂 醋酸双氧铀：显示蛋白质、核酸和胶原纤维。缺 点，具有放 射性和化学毒性。染色30分钟。35℃ 枸橼酸铅： 对膜结构和脂肪染色好。缺点容易和空气中的二 氧化碳结合产生碳酸铅，污染样品。染色30分钟 第二节、SEM生物样品制备技术 SEM适用于生物样品表面及其断面的微细结构观察。生 物样品具有含水量大、质地柔软、干燥脱水易变形、机械强 度低，不能耐受电子束轰击、多数生物组织是由原子序数较 低的元素组成，具有二次电子发生率低的特点。样品制备时 需遵守以下原则。 1、SEM生物样品制备的基本要求 ⑴、每一处理过程都应防止样品的污染和损伤，保持样品原 有的形貌和微细结构。 ⑵、去除样品内的水分，干燥过程中尽量减少样品体积的变 化和人工损伤。 ⑶、增强样品的导电性，提高二次电子发射率。 ⑷、注意保护样品的观察面。 2、SEM样品的制备方法 ⑴ 常规制备法 取材 清洗 固定 脱水 干燥 镀膜 SEM观察 ⑵ 内部结构剖出法 取材 1%OsO4固定 DMSO固化割断 0.1%OsO4 软化基质， 突出膜性结构 1%OsO4后固定固割断面 2%单宁酸组织导 电处理 脱水 干燥镀膜 SEM观察。 ⑶ 单宁酸－四氧化锇组织导电法 样品灌流固定 2%单宁酸＋ 2%戊二醛混合液 30分钟（表 面样品）8小时（内部结构）导电处理 0.1M磷酸缓冲液清洗 2%OsO4后固定 脱水干燥 镀膜 SEM观察。 3、SEM生物样品制备程序 ⑴ 取材 A：取材前应制备好药品和器具。 B：取材样品要新鲜，标记好样品的观察面。 C：取材部位准确，大小在3X5mm³左右，数量要少。 ⑵ 清洗 SEM观察，对样品表面的清洗十分严格，覆盖在样品 表面的血液、组织液、粘液必须清洗干净，防止对微细结构的 掩盖。在制样过程中共有三次清洗，第一次用清洗液洗掉样品 表面的杂质，第二、三次是除掉没有和样品成份发生反应的固 定液。根据样品的性质选择不同的清洗液。 A：对样品表面的血液和组织液，用生理盐水和缓冲液冲洗。 B：对空腔器官表面的粘液，用不同浓度的蛋白水解酶处理。 C：对一些特殊的组织，用特殊方法清洗。例如，内耳螺旋器 的 胶质膜，盐酸浸泡。乳腺组织用乙醇和甘油处理。 ⑶ 固定 与TEM一样，为了把生物样品的微细结构和外貌真实的保 留下来，样品必须进行固定处理。通过固定使组织硬化，提高 样品在干燥过程中的耐受表面张力和电子束轰击。常用方法为 戊二醛和四氧化锇双重固定法。 ⑷ 脱水 SEM样品体积大，脱水可以防止样品在高真空下变形，脱水 剂为乙醇，采用梯度脱水法，用乙醇逐步取代样品中的水份。 在脱水过程中应防止样品暴露在空气中，发生干燥变形等。 ⑸ 干燥 A 干燥的目的：样品经脱水后水份被脱水剂取代，样品内含 有脱水剂和少量残存的水分，特别是样品表面的脱水剂和残留 水分所形成的表面张力，使样品表面结构严重破坏。干燥的目 的是去除样品内残留的水分和脱水剂，保存样品的表面形貌。 B 干燥方法： b1 空气干燥法 ：这是一种最简便最原始的干燥法，将经过 常规固定的样品，放入低表面张力的液体内（丙酮、乙醇、乙 醚等），采用梯度法置换出样品内的水分，然后再把样品放在 空气中，使其样品所含的溶剂自然挥发，而达到干燥的目的。 此法只适用于比较坚硬或具有鳞片及含水分较少的生物样品。 b2 叔丁醇干燥法 ：叔丁醇是一种有机溶剂，它的溶点为 25.5℃，经脱水后的样品，置于100％叔丁醇内经冷冻降温至 10℃左右变为固态，在真空镀膜机内，使固态的叔丁醇逐渐升 华变成气态，以达到干燥的目的。 b3 CO2临界点干燥法 ：这是目前认为最可靠而理想的样品干 燥法。CO2临界点干燥是利用液体二氧化碳在临界状态下液相 消失而没有表面张力的特点，使生物标本达到干燥的目的。 临界点干燥的原理： 根据物质存在着临界状态的特性，用HCP－2型临界点干 燥器进行样品干燥。在温度和压力的变动下，物质所存在的固 态、液态和气态这三种形式可以相互转化，当温度和压力升到 一定数值时，气体的密度增大与液体一样，此时气相和液相的 界面消失，液体表面张力消失。物理学中将这种情况称为临界 状态，此时的温度和压力分别为临界温度及临界压力。临界点 干燥就是利于物质在临界状态下，液体表面张力被消除的特性， 克服样品干燥过程中的变形，保持样品原貌。 临界点干燥的步骤和中间剂 临界点干燥处理包括两次置换和临界状态下干燥三步。第 一步用中间剂醋酸异物酯置换脱水剂，第二步用干燥剂置换脱 水剂，第三步是临界状态下干燥，使干燥剂进入临界状态，从 而达到样品的干燥。 ⑹ 样品的粘胶 干燥处理后的样品，需用SEM专用导电胶粘贴在金属样品座上。 目的：保证样品在样品台上不移动，防止脱落，尤其在倾斜 和旋转时。导电胶可以增强样品与样品台之间的导电 性，使样品上聚集的电子能通过导电胶传递到样品台 上。 方法：①样品的大小和形状不同，宜采用相应的粘贴方式， 不能因涂胶过多而掩盖要观察的结构。 ②粘贴样品前，要确实认准观察面，保证观察面向上。 ③经脱水和干燥处理后的样品，脆而易碎，粘贴时动 作要轻柔，防止反复夹持样品。 ④样品粘贴后，要待导电胶干透后再进行金属镀膜。 ⑺ 样品的导电处理 生物样品电阻很大，导电性也很差，当接受电子束照射时， 会在样品表面形成电子的堆积，称为放电效应，因而影响SEM 的观察。为能得到理想的图像，必须对样品进行导电处理。常 用的导电方法有 离子镀膜法：Ion coating 又称离子溅射，是增强生物样品导电性能比较理想的方法。 其工作原理，在该机真空罩的顶部和底部分别装有阴极和阳极， 阴极的内表面有一金属靶，样品放在阳极上，当罩内真空度达 到1×10¯ ²托低真空时，在 两极间加以1000～3000V的直流电压。 在电场的作用下，使罩内残留的气体分子被电离为阳离子和电 子，它们分别飞向阳极和阴极，同时阳离子又可轰击阴极上的 金属靶，使部分金属原子被溅射出来，这些金属原子在电场的 加速作用和气体分子的碰击下，以不同的方向和角度飞向阳极， 并呈漫散射的方式覆盖在样品的表面，形成一层连续而均匀的 金属膜。 IB－3 型 离 子 镀 膜 仪 原 理 离子镀膜的技术要求 ① 样品在离子镀膜前，必须进行严格的脱水和干燥处理， 若样品干燥不充分，金属离子不仅不能很好的附着，反而 会损伤样品，特别是放出的有机气体，会因为受电离而分 解，给样品带来“黑化污染”。 ② 镀膜时，样品要放在金属靶的正下方不能超过阳极板面 积的80％， 样品数目虽不限，但其总面积要控制在靶面积 的三分之一以内。离子溅射速度与样品到靶极的距离成反 比，距离大溅射的速度慢，当两极间的电压与样品到靶极 的距离不变时，可通过对溅射时间的控制来掌握镀膜的厚 度。 组织导电技术 Tissue conduction techniques 是利用金属盐类、特别是重金属盐类化合物，与生物组织 内蛋白质、脂类和淀粉起化学结合作用，以达到样品表面离子 化，增强导电性及耐电子束轰击的能力。如将组织导电技术和 金属镀膜结合使用，将会制出更为理想的高分辨生物样品。常 用的组织导电法为单宁酸－锇酸法。