Transcript 实验6 人类染色体的制备及G显带核型分析-liu

人类染色体标本的制备
及G显带核型分析
安徽医科大学基础医学院生物学教研室
[目的和要求]
1. 掌握染色体标本的制备方法和G显带技术。
2. 熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法及G显带
染色体的核型分析技术。
[实验原理]
染色体作为细胞遗传信息的载体，出现于有丝分
裂期。用于人类染色体标本制备的材料可为骨髓细胞、
外周血淋巴细胞、绒毛细胞、羊水细胞等。其中最简
便的就是抽取少量外周静脉血进行短期培养，经秋水
仙素处理（秋水仙素可阻断有丝分裂期细胞中微管的
聚集，使纺锤体不能形成，从而使有丝分裂停滞在中
期时相，此时染色体具有最典型的形态），再经低渗、
固定等处理，获得更多的中期分裂相以用于核型分析。

染色体的带纹是染色体标本经过特殊处理后，每条
染色体上沿纵轴显示出的一定数量、着色程度不同、
宽窄不等的横纹。染色体带是染色体固有的、稳定
的特征。染色体G显带是多种显带技术中的一种，是
将染色体标本经胰蛋白酶处理后再用吉姆萨
（Giemsa）染液染色。G显带技术因其方法简便，重
复性好，带纹清晰且可长期保存而应用最为广泛。

核型是指一个体细胞有丝分裂中期的所有染色体，
并按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。每
一个体细胞含有两组同样的染色体，用2n表示。

染色体核型分析是细胞遗传学的重要研究手段，在
临床多种疾病如染色体病、白血病、肿瘤等的诊断
及研究中具有重要意义。
基因组与核型
基因组：生物体内单倍体染色体组成叫做生物体的
基因组(genome)，它代表了一个生物体染色体中储
存的全部遗传信息。
人类体细胞的正常核型
大
小
组
染色体号
A组
1
B组
4 ———— 5
亚中着丝粒染色体、无随体
C组
6 ———— 12、X
亚中着丝粒染色体
D组
13 ———— 15
近端着丝粒染色体、有随体
E组
17
F组
19 ———— 20
G组
21———— 22、Y
2
16
3
18
主要特征
中央着丝粒染色体
亚中着丝粒染色体
中央着丝粒染色体
亚中着丝粒染色体
中央着丝粒染色体
近端着丝粒染色体、有随体
Y染色体略大、长臂平行伸展、无随体
6
正常男性：46，XY
正常女性：46，XX
3
54
3
2
1
2
2
1
3
21
p
显带染色体：用特殊的染色方法使
染色体沿其长轴显示
出明暗交替或染色深
浅不同的横纹——带。 q
1
1
2
3
4
1
2
1
2
3
4
5
1
2
1
23
4
正常人体细胞染色体带型模式图
[实验用品]



1．器具：采血器具、超净工作台、培养瓶、恒温
培养箱、恒温水浴锅、10 ml刻度离心管、低
速离心机、量筒、载玻片、托盘天平、光学
显微镜、染缸、电吹风、酒精灯、剪刀、胶水。
2．材料：人外周静脉血。
3．试剂：RPMI-1640培养液、小牛血清、肝素、植
物血凝素（PHA）、秋水仙素(20μg/ml)、
0.075 mol/L氯化钾低渗液、0.85%生理盐水、
固定液（甲醇:冰醋酸=3:1，现配现用）、
Giemsa原液、0.25%胰蛋白酶溶液、磷酸盐缓冲
液。
[实验步骤]

(一)人类外周血染色体标本的制备

1．采集人外周静脉血1ml，迅速与适量肝素混匀抗凝。




2. 超净工作台内将抗凝血加入RPMI-1640培养液中，每
瓶加0.3～0.5 ml全血。轻轻混匀。
3. 37℃恒温培养箱静置培养72 h左右（培养24 h后水平
轻摇培养瓶一次，以悬浮混匀血细胞）。
4. 培养至68～72 h（即终止培养前2～4 h），每瓶加秋
水仙素(20 μg/ml)至终浓度0.1～0.2 μg/ml，轻摇
培养瓶混匀，继续培养2～4 h。
5. 终止培养，将培养物吹打混匀后转移到10 ml玻璃离
心管，配平，1800 rpm 离心6 min。
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6. 低渗 弃上清。加入37℃预温的0.075 mol/L氯化钾
8 ml，吸管轻轻吹打混匀，37℃低渗处理20 min。
7. 预固定 加入1ml 新鲜配制的固定液（甲醇:冰醋酸
=3:1），轻轻混匀，1800 rpm 离心6 min。
8. 固定：弃上清，加入上述新鲜固定液8 ml，轻轻混
匀，室温下静置固定20 min。
9. 弃上清，重复固定1次。
10.弃上清，根据沉淀量多少加入适量滴数新鲜固定
液，轻轻混匀，制成磨砂状悬液。
11.制片：取上述悬液1～2滴，滴至沾有冰水或干燥的
洁净载玻片上，吹散，过火，空气干燥。
12.37℃温箱放置3～4天或70℃烘烤2 h进行老化处
理，以备显带分析用。
(二)人类染色体的G显带
【实验方法和步骤】
1.胰蛋白酶准备：在盛有45 ml 0.85%生理盐水的染缸
中加3 ml 0.25%胰蛋白酶溶液，调节pH值至6.8～
1、预处理：实验前3---4小时，取健康小鼠，每只
7.2，置37℃恒温水浴锅中预温。
腹腔注射0．01％ 秋水仙素0．3-- 2.胰蛋白酶消化处理：将经老化处理的标本片放入胰蛋
0．4ml。注意不要伤及内脏。
白酶溶液中处理2～3
min，不断轻摇载玻片以保证
2、取股骨：用一只手的拇指和食指按住小鼠
作用均匀充分。
的头部，另一只手 拉住它的尾巴，用
 3.漂洗：迅速用0.85%生理盐水漂洗，以终止胰蛋白酶
的作用。 力向后拉断其颈椎。处死后立即用剪
刀剪 开后腿上的皮毛，取出小鼠的股
 4.染色：用吉姆萨工作液染色10～15 min。
骨，剔除上面的肌肉，洗净。
 5.冲洗干燥：用缓流自来水冲洗载玻片，空气干燥或电
吹风吹干。
 6.镜检：光学显微镜下观察分析核型。

(三) G显带的核型分析
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

1.选取染色体分散良好、长度适中染色体G显带核型
照片，首先进行计数，然后将每条染色体剪下。
2.配对：同源染色体形态相同，带型一样；非同源染
色体的大小，形态等带型各异，根据这个原理，按照
染色体的大小、形态、着丝粒的位置，随体的有无和G
显带带型等特征将46条染色体配成23对。
3.染色体排列：将配成23对的染色体按大小次序排列，
一对性染色体排在最后，并把排列好的23对染色体分
组贴附于实验报告纸上。这样，经过剪贴配对好的正
常人体染色体图即为正常人体核型图，可写成
46,XX或46,XY。
正常男性染色体G-显带核型
人类染色体G-显带特征口诀：
一秃二蛇三蝶飘
六号是个小白脸
十号长臂近带好
十三四十五
十六q2缢痕大
十八人小肚皮大
二十头重又脚轻
二十二头带小黑帽
四鞭炮五黑腰
七上八下九苗条
十一低来十二高
下、中、上
十七长臂带脚镣
十九一点腰
二十一象个葫芦瓢
X一担挑，Y是黑脚
[注意事项]

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1. 染色体标本制备中的关键因素包括秋水仙素的用量
和作用时间、低渗和固定的处理。其中低渗时间很重要，
处理时间过长则细胞膜过早破裂导致染色体丢失，处理
时间不足则致染色体分散不好，不利于计数分析。
2. G显带过程中的关键因素包括胰蛋白酶的作用时间、
温度、pH等。其中胰蛋白酶溶液应37℃充分预热，溶液
pH应维持在6.8～7.2，以保证酶活性的发挥。另外消化
要适度，消化不足则带纹不清晰或不显示，消化过度则
带纹模糊甚至损失。
[作业与思考题]


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1.简述人类染色体制备的操作过程和基本原理。
2.总结人类染色体制备过程中的关键步骤及注意
事项。
3.制作人的G显带正常核型配对分析图。