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实验一 细胞器的光学显微镜观 察 实验目的 • 1、观察人、植物活细胞内线粒体和液泡系 的形态、数量与分布 • 2、学习一些细胞器的超活染色技术 实验原理 • 活体染色：能使生活有机体的细胞或组织特异性着色但对活样品又没 有毒害作用的一种活体染色方法，其目的是显示生活细胞内的某些结 构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细 胞的死亡。活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生 理、病理状态。 • 超活染色：体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出 部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的 某种结构上而显色。活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊 的部分，主要是靠染料的“电化学”特性。碱性染料的胶粒表面带阳 离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有 阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但并非任 何染料均可用于活体染色，理论上应选择那些对细胞无毒性或毒性极 小的染料，且使用时需要配成稀淡的溶液。一般说来，最为适用的是 碱性染料，这可能是因为它具有溶解在类脂质(如卵磷脂、胆固醇等) 的特性，易于被细胞吸收。詹纳斯绿B(Janus green B)和中性红 (neutral red)两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线 粒体和液泡系的染色分别具有专一性。 • 生物学实验中使用的染色剂分为酸性、碱性和中性，染色 剂的酸碱性与化学上用H+的离子浓度来定义溶液的酸碱性 不同，染色剂的酸碱性与染色剂的显色基团有关，由主要 显色基团是阳离子或是阴离子来确定，若染色剂的主要显 色基团是阳离子，为碱性染色剂；若染色剂的主要显色基 团为阴离子，为酸性染色剂；若染色剂的显色基团既有阳 离子也有阴离子则称为中性染色剂（又称复合染料）。有 丝分裂实验用的醋酸洋红和龙胆紫溶液的显色基团均为阳 离子，故都是碱性染色剂，亚甲基蓝、美蓝也是碱性染料； 酸性品红、伊红是酸性染料，苏丹Ⅲ、苏丹Ⅳ弱酸性染料； 对血液进行染色的赖特和吉姆萨是中性染色剂。 • 在细胞的组成中，原生质的碱性部分（如细胞质）容 易与含阴离子的酸性染料发生亲合力而结合；而原生质的 酸性部分（如染色质）容易与含阳离子的碱性染料发生亲 合力而发生作用。而红细胞具有特殊的性质能与中性染色 剂发生亲合力。由此可见细胞成分被染色的强弱与细胞成 分的酸碱性以及染料的性质有关。 • 染色剂溶液的酸碱性 • 染色剂溶液的酸碱性是指染料溶液的pH值，例如醋酸洋红和龙胆紫 溶液均为碱性染料，但它们的溶液却是酸性，而曙红为酸性染料但溶 液是碱性，又如中性红是碱性染料而它的溶液呈中性。 • 染色剂溶液的酸碱性与试剂的成分、反应条件以及染料的溶解度等 因素有关。如斐林试剂需要新配制的Cu(OH)2溶液，而双缩脲试剂需 要碱性条件的Cu2+与蛋白质的肽键反应形成紫色或紫红色的络合物。 又如洋红的等电点是pH4.07-4.5，此时洋红的溶解度最小，只有在高 于或低于它的等电点的溶液中才易溶解，醋酸洋红的溶液呈酸性，但 它的显色基团的化学性质没有改变，其中的醋酸分子穿透组织的速度 快，并能够凝固核蛋白，更有利于对染色体的染色。同样用2%的醋酸 配制的1%龙胆紫溶液呈酸性，它对根尖分生区细胞内染色剂的染色效 果要好于1%龙胆紫水溶液。 • 由此可见染色剂的酸碱性不是指染色剂溶液的pH值，而是指染色剂 对物质进行染色时与显色有关的主要基团是阳离子还是阴离子 • 线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的 场所。细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所，细胞的 各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提 供的。细胞中线粒体的具体数目取决于细胞的代谢水平， 代谢活动越旺盛，线粒体越多。线粒体可占到细胞质体积 的25%。一般真核细胞中含成百上千个线粒体，植物因有 叶绿体的缘故，线粒体数目相对较少，单细胞鞭毛藻仅1 个，酵母细胞具有一个大型分支的线粒体，巨大变形中达 50万个；许多哺乳动物成熟的红细胞中无线粒体 。线粒 体的形状多种多样, 一般呈线状,也有粒状或短线状。线 粒体的直径一般在0.5～1.0 μm， 在长度上变化很大, 一般为1.5～3μm，长的可达10μm ，人的成纤维细胞的 线粒体则更长，可达40μm，在胰脏外分泌细胞中可长达 10~20μm，称巨线粒体 。不同组织在不同条件下有时会 出现体积异常膨大的线粒体, 称为巨型线粒体 (megamitochondria)。分布在细胞功能旺盛的区域。詹纳 斯绿 B是线垃体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素 氧化酶使染料保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色，而在 周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。 • 液泡是细胞内浓缩产物的主要场所，有十分重要的功能。液泡的功能 主要是调节细胞渗透压，维持细胞内水分平衡，积累和贮存养料及多 种代谢产物。液泡膜具有特殊的选择透性，使液泡具有高渗性质，引 起水分向液泡内运动，对调节细胞渗透压、维持膨压有很大关系，并 且能使多种物质在液泡内贮存和积累。贮存和积累在液泡中的物质包 括糖、蛋白质、磷脂、单宁、有机酸、植物碱、色素和盐类等。具体 情况因植物种类、器官组织部位，成熟程度等的不同而异。液泡是植 物细胞质中的泡状结构。幼小的植物细胞（分生组织细胞），具有许 多小而分散的液泡，在电子显微镜下才能看到。以后随着细胞的生长， 液泡也长大，互相并合，最后在细胞中央形成一个大的中央液泡，它 可占据细胞体积的90％以上。这时，细胞质的其余部分，连同细胞核 一起，被挤成为紧贴细胞壁的一个薄层。有些细胞成熟时，也可以同 时保留几个较大的液泡，这样，细胞核就被液泡所分割成的细胞质索 悬挂于细胞的中央。具有一个大的中央液泡是成熟的植物生活细胞的 显著特征，也是植物细胞与动物细胞在结构上的明显区别之一。中性 红为弱碱性染料，对液泡的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染 成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能是与液泡中某些蛋白质 有关。 线粒体 • 分生区：分生区一般全长约1～2毫米，大部分被根冠包围 着，是产生新细胞的主要地方。属于分生组织，能使根尖 细胞数目不断增加。细胞排列紧密，壁薄、核大、质稠。 伸长区：位于生长点和根毛区之间，长度约为几毫米。伸 长区细胞逐渐伸长，细胞中液泡开始加大，细胞质和细胞 核逐渐被液泡挤到细胞边缘。 根的生长主要靠生长点细胞分裂（细胞数目增加）和伸长 区细胞的伸长。由于细胞伸长可以达到原来细胞大小的几 十倍，因此伸长区的伸长很显著 根毛区：根毛区也叫成熟区。因为此区的细胞已停止生长， 属于成熟的细胞。在成熟区最外一层的表皮细胞，它的细 胞膜、细胞质向外突起逐渐形成根毛。也就是说：根毛是 由一个表皮细胞形成的。它的细胞壁极薄，是柔软而胶粘 的，有可塑性，易与土粒紧贴在一起，有效地进行吸收作 用。成熟区是根吸收水分和无机盐的主要部位。 实验仪器与材料： 1、 器材: 显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、双面刀片、解剖盘．载玻 片、凹面载玻片、盖玻片、表面皿、吸管、牙签、吸水纸 2、 试剂： Ringer溶液（使细胞保持活性）， 1/3000中性红溶液（配好 后需装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力）， 1/5000詹纳斯绿B 3 、材料： 人体口腔黏膜上皮细胞、洋葱鳞茎内表皮细胞、小麦根尖 实验步骤： • • • • • • 1、人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察 清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上 ↓ 滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液 ↓ 用牙签口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞（稍微用牙签在峡侧黏膜上涂刮几 下就行了，不一定要看到把皮给刮下来的，只要牙签刮了黏膜就会有细胞） • ↓ • 刮下的粘液状物放大载玻片的染液滴中 • ↓ • 染色10~l5min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液) • ↓ • 盖上盖玻片,显微镜下观察 • • • • • • • • • • 2、植物细胞液泡系的超活染色与观察 取豆芽的根尖 ↓用刀片纵切根尖 放入中性红染液滴中，染色5~10min。 ↓ 吸去染液，滴一滴Ringer液 ↓ 盖上盖玻片进行镜检(镊子轻轻地下压盖玻片，使根尖压扁，利于观察) 实 验 结 果 在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见细胞质中散在很多大 小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡，这是初生的幼小液泡。然后，由生长点 向延长区观察，在一些已分化长大的细胞内，液泡的染色较浅，体积增大， 数目变少。在成熟区细胞中，一般只有一个淡红色的巨大液泡，占据细胞的 绝大部分，将细胞核挤到细胞一侧贴近细胞壁处。 实验报告 • （1）. 绘口腔上皮细胞示线粒体的分布 、 洋葱鳞茎表皮细胞中线粒体的分布图 • （2）.根尖液泡的分布图 • （3）.何为活体染色和超活体染色 实验二 细胞骨架的显示和观察 实验目的 • 掌握植物细胞骨架的光镜标本制作方法 • 了解植物细胞的细胞骨架基本形态 实验原理 • 细胞骨架是指细胞质中纵横交错的纤维网络结构， 按组成成分和形态结构的不同可分为微管（MT）、 微丝（MF）和中间纤维（IF）。广义的细胞骨架还 包括核骨架（nucleoskeleton）、核纤层（nuclear lamina）和细胞外基质（extracellular matrix）， 形成贯穿于细胞核、细胞质、细胞外的一体化网络 结构。 • 它们对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、 分化和物质运输等起重要作用。光学显微镜下细胞 骨架的形态学观察多用1% （曲拉通100）Triton X100（聚乙二醇辛基苯基醚）处理细胞，可使细胞膜 溶解，使95%以上的可溶性蛋白质以及全部脂质被抽 提，而细胞骨架系统的蛋白质被保存， 再用考马斯 亮兰R250染色，使得胞质中细胞骨架得以清晰显现。 微丝功能 • 维持细胞形态，赋予质膜机械强度 • 细胞运动：成纤维细胞爬行与微丝装配和解聚相关 • 微绒毛(microvillus)： –是肠上皮细胞的指状突起，用以增加肠上皮细胞表面积， 以利于营养的快速吸收。 • 应力纤维(stress fiber)： –在形成粘合斑的质膜下，微丝紧密平行排列成束，形成 应力纤维,具有收缩功能。 • 参与胞质分裂： –收缩环由大量反向平行排列的微丝组成，其收缩机制是 肌动蛋白和肌球蛋白相对滑动。 • 肌肉收缩(muscle contraction) 微管的功能 • 维持细胞形态 –用秋水仙素处理细胞破坏微管,导致细胞变圆,说明微 管对维持细胞的不对称形状是重要的。对于细胞突起 部分,如纤毛、鞭毛、轴突的形成和维持, 微管亦起关 键作用。 • 细胞内物质的运输 • 细胞器的定位 • 鞭毛(flagella)运动和纤毛(cilia)运动 –纤毛与鞭毛的结构 –纤毛运动机制 • 纺锤体与染色体运动 中间纤维的功能 • 增强细胞抗机械压力的能力 • 角蛋白纤维参与桥粒的形成和维持 • 结蛋白纤维是肌肉Z盘的重要结构组分，对于维持 肌肉细胞的收缩装置起重要作用 • 参与传递细胞内机械的或分子的信息 • 中间纤维与mRNA的运输有关 实验步骤（第一种方法） 第二种方法 • 取洋葱的外表皮2 张, 大小约为0 .5 cm×0 .5 cm, 放到培养皿中 • 用0 .01 mol / L 磷酸盐缓冲生理盐水( PBS) 浸泡取得的洋葱外表 皮3 次, 每次3min; • 再加1% Triton X-100/ M- 缓冲液处理洋葱外表皮约30min; • 再用M- 缓冲液浸泡3 次, 每次5 min ; • 加甲醇- 冰醋酸混合细胞固定液（甲醇- 冰醋酸混合液3∶1 ）固定 细胞, 固定15 ～30 min; • 用0 .01 mol / L 磷酸盐缓冲生理盐水( PBS) 清洗细胞3 次, 每次 3 min ; • 用镊子将洋葱外表皮细胞取出放到载玻片上, 铺平后用滤纸把水吸干; • 滴加0 .2% 考马斯亮蓝R250 染液染色30 min; • 用水冲洗细胞, • 等到自然干燥后即可观察。 注:a . 染色15 min ;b . 染色60 min 。 Note :a . Staining for 15 min ; b . Staining for 60 min . 图1 0.2%考马斯亮蓝R250 染液染色后洋葱表皮细胞(40 ×16) Fig .1 Onionepidermal cell after staining with0.2% Coomassie brilliant blue R250dyeing solution(40 ×16) 而染色30 和60 min 的照片图像所观察到的效果明显比染色15 min 的好, 但染色60 min 的效果更佳, 图像十分清晰。结果表明, 染色时间一般至少要超过30 min, 染色60 min 的 效果比较好。 实验三 细胞形态结构的观察 实验目的 • • • • 1、掌握光镜下细胞基本形态结构 2、初步掌握临时制片的方法 3、学习生物绘图的方法 4、 认识血涂片中红细胞及各类白细胞的 形态构造特点. • 5、 进一步掌握光学显微镜的使用方法 1、细胞生物学实验绘图方法与要求 • 一、在仔细观察的基础上，选择典型结构进行描 绘，要求真实、准确(注意各部结构的比例关系)。 • 二、用铅笔绘图，线条要明确清晰，图的深浅明 暗一律以点的疏密来表示，点要圆而一致，不得 涂暗影或进行其它美术加工。 • 三、各部结构名称要在一侧引直线注明。各引线 要平行不得交叉。 • 四、每幅图的大小、位置在纸面上必须安排得当 并注意纸面的整洁。 2、各种细胞形态 • 上皮细胞（人口腔上皮、小肠切片） 单层扁平上皮：人口腔上皮细胞，细 胞轮廓呈多边形或不规则的波浪形， 每个细胞内有一个圆形核； • 骨骼肌（横切和纵切） 骨骼肌由骨骼肌纤维构成。骨骼肌纤 维是长圆柱状细胞，每一条肌纤维内 有大量圆形细胞核（可多达上百个）。 其细胞质又称肌浆，含有丰富的肌原 纤维、线粒体和脂肪滴等。肌原纤维 呈细丝状，沿细胞长轴平行排列。每 条肌原纤维都具有明暗相间的带。 • 神经元细胞 神经细胞由两部分组成，即细胞主体 和突起。用于感受刺激与传导冲动。 • 不论细胞的形状如何，细胞的结构一 般分为三大部分：细胞膜、细胞质和 细胞核。但也有例外。例如：哺乳类 红细胞成熟时细胞核消失。 平滑肌细胞 神经细胞 • 哺乳动物的红细胞呈扁圆形、体积 很小，是一种非常特化的细胞。哺 乳动物的红细胞无核，亦无其它重 要细胞器，主要是由细胞膜包着血 红蛋白。这些特点与红细胞交换氧 与二氧化碳的功能密切相关。细胞 体积小、呈圆形，非常有利于在血 管内快速运行，体积小则相对表面 积大，有利于提高气体交换效率。 细胞内主要是血红蛋白，有助于结 合更多的氧与二氧化碳。因此，红 细胞的形态和结构装置与其交换气 体的功能的关系是非常合理的。 • 精子在细胞后端具有能运动的鞭毛， 前端具有有助于进入卵的顶体 红细胞模式图，凹圆盘形，无核 3、实验原理 • 1、细胞体积虽然差别很大，但大多数都必 须借助显微镜观察； • 2、细胞内含水较多，不染色不易观察，故 需用生物染料染色。 4、各种细胞一般形态结构的观察 • • • • • • • • • • • • • 1、洋葱鳞茎表皮细胞的标本制备与观察 （1）标本制作 （2）观察： 2、人口腔黏膜上皮细胞标本的制备与观察 （1）标本制作 （2）观察： 3、血涂片的制作与血细胞的观察 （1）采血与涂片 （2）染色 （3）观察 4、立体细胞的观察 （1）标本制作 （2）观察 采血前用70％酒精棉球 消毒人的指腹 采血 由于第一滴血中含单核白细胞较多， 因此弃去第一滴血。 推片：挤出第二滴血置于载玻片的右侧 再取另一张边缘光滑的双凹片，斜置于血滴的前缘， 先向后稍移动轻轻触及血滴，使血液沿玻片端展开 成线状。 两玻片的角度以30~45°为宜，轻轻将双凹片向 前匀速推进，即涂成血液薄膜。 30~45° 染色 • 待涂片在空气中完全干燥 后，滴加数滴Wright’s染 液盖满血膜为止，染色 1～3 min。然后滴加等量 蒸馏水，使其与染液均匀 混合，静置10～15 min。 用蒸馏水冲去染液，吸水 纸吸干，镜检。 结果显示 淋巴细胞 单核细胞 嗜中性粒细胞 嗜酸性粒细胞 嗜碱性粒细胞