实验三：线粒体及液泡系的活体染色

【实验目的】

1.通过制片掌握活体染色方法； 2.熟悉在耳缘静脉用空气栓塞处死兔子的方法； 3.了解线粒体及液泡系在光镜及电镜下的基本形态结构

【实验原理】

 活体染色是指对生活有机体的细胞或组织 能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的 是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞 的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引 起细胞的死亡。活染技术可用来研究生活状态 下的细胞形态结构和生理、病理状态。

【实验原理】

 根据所用染色剂的性质和染色方法不同，通常 把活体染色分为体内活染和体外活染两类。体 内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体 内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊 结构里，达到易于识别的目的。体外活染又称 超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细 胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择 固定在活细胞的某种结构上而显色。

【实验原理】

 活体染色之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分， 主要是染料的“电化学”特性起重要作用。碱性燃料的胶 粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被 染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，他们彼此 就发生了吸引作用。但不是任何染料都可以作为活体染色 剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，而 且总要配成稀淡的溶液来使用。一般是以碱性染料最为适 用，可能因为它具有溶解在类脂质的特性，易于被细胞吸 收，Janus green B和中性红两种碱性染料是活体染色剂中 最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。

【仪器、材料与试剂】

（一）仪器 显微镜,载玻片,盖玻片,刀片,吸水纸镜头纸,恒温 水浴锅,解剖盘,剪刀,表面皿,牙签,凹面载玻片 （二）材料 小白鼠肝细胞或兔子的肝脏细胞 小麦或黄豆幼 根根尖 （三）试剂 Ringer溶液 10%、1/3000中性红溶液 1%、 1/5000Janus green B溶液

【实验步骤】

（一）兔肝细胞线粒体的活体染色 1.用空气栓塞处死兔子，置于解剖盘内，迅速打 开腹腔，取兔肝边缘较薄的肝组织一小块 （2～3mm3），放入盛有Ringer氏液的平皿内 洗去血液(用镊子轻压).

2.用吸管吸去Ringer氏液，在平皿内加1／300詹 纳斯绿B染液，让组织块上表面露在染液外面， 使细胞内线粒体的酶系可进行充分的氧化，这 样才有利于保持染料的氧化状态，使线粒体着 色。

【实验步骤】

3.当组织块边缘染成篮色时即可，一般需要染30 分钟。 染色后，将组织块移到载片上，用镊 子将组织块拉碎，就会有一些细胞或细胞群从 组织块脱离。 4.将稍大的组织块去掉，使游离的细胞或细胞群 留在载片上，加一滴Ringer氏液，盖上盖片， 吸去多余水分。 5.显微镜观察，肝细胞质中许多线粒体被染成蓝 绿色，呈颗粒状。

(二)植物细胞液泡系观察

     1.取豆芽的根尖,用刀片综切根尖.

2.放入中性红染液中,染色5-10min 3.吸去染液,滴一滴Ringer液.

4.盖上盖玻片进行镜检.

5.在高倍镜下,先观察根尖部分的生长点细胞,可见细胞 质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡,这 是初生的幼小液泡.然后,由生长点向延长区观察,在一 些已分化的细胞内,液泡的染色较浅,体积增大,数目变 少.在成熟区细胞中,一般只有一个淡红色的巨大液泡, 占据细胞的绝大部分,将细胞核挤到细胞一侧.

【实验报告】



画出你所观察到的线粒体和液泡的图像.



总结实验成功或失败的原因.

【思考题】

 1. 用一种活体染色剂对细胞进行超活染色，为 什么不能同时观察到线粒体、液泡系等多种细 胞器？  2. 小麦或黄豆根尖经中性红超活染色，为什么 看到生长点的细胞中液泡多，而且染色深，延 长区细胞中液泡数量变少，染色浅？  3. 为什么要取兔肝边缘较薄的肝组织