Transcript ตัวอย่างพืชแปลงพันธุ์ที่ได้จากการใช้ Agrobacterium (2) Direct gene

Plant
Improvement
by
Biotechnology
เทคโนโลยีชีวภาพ (Biotechnology)
เทคนิคใดๆก็ตามที่นาเอาสิ่ งมีชีวิต หรือ
ชิ้นส่ วนของสิ่ งมีชีวติ มาพัฒนา หรือปรับปรุง
ผลิตภัณฑ์ ปรับปรุงพืช, สั ตว์ หรือจุลนิ ทรีย์เพือ่
ใช้ ประโยชน์ โดยเฉพาะ
พันธุวศิ วกรรม
(Genetic engineering
หรือ recombinant DNA technology)
เป็ นเทคนิคที่เกีย่ วข้ องกับการตัดต่ อ gene
หรือสารพันธุกรรม เพือ่ ให้ เกิดการเปลีย่ นแปลง
ทางลักษณะพันธุกรรมของพืช, สั ตว์ หรือจุลนิ ทรีย์
GMOs
(genetically modified organisms)
สิ่ งมีชีวติ ดัดแปลงพันธุกรรม เป็ นสิ่ งที่
มนุษย์ สร้ างขึน้ ด้ วยเทคนิคพันธุวศิ วกรรม
(genetic engineering)
# GMO บางครั้งใช้ LMO
L
M
O
(Living Modified Organism)
LMO เป็ นความมีชีวติ ของสิ่ งมีชีวติ
ใน
ขณะที่ GMO รวมไปถึงผลิตภัณฑ์ ที่
เกิด
ขึน้ ในสภาพที่ไม่ มีชีวติ เช่ น อาหาร
Plant genetic engineering
วิธีการตัดต่ อ gene หรือสารพันธุกรรมของพืช
เพือ่ ให้ มกี ารเปลีย่ นแปลง ลักษณะทางพันธุกรรม
พืชทีผ่ ลิตได้ จากวิธีนี้ เรียก พืชแปลงพันธุ์ หรือ
พืชจาลองพันธุ์ (Transgenic plants)
พืชแปลงพันธ์ ุ?
เป็ นพืชที่มีการดัดแปลง ตกแต่ งสาร
พันธุกรรม (genetically modified) โดยได้ รับ
การส่ งถ่ ายยีน จากสิ่ งมีชีวติ ชนิดเดียวกัน
หรือ ชนิดอืน่ ทาให้ มี
ลักษณะตามต้ องการ
ความหมายของการส่ งถ่ ายจีนสู่ พชื
กระบวนการส่ งถ่ ายยีนที่สนใจ (gene of interest) เข้ า
สู่ พชื ไม่ จาเป็ นต้ องเป็ นยีนจากพืชเสมอไป
ยีนที่ส่งถ่ ายเข้ าไปต้ องสอดแทรกกับโครโมโซมของ
พืช
อย่ างเสถียร ผ่ านขั้นตอนการแบ่ งเซลล์ แบบ Mitosis
และ Meiosis
การสร้ างพืชแปลงพันธ์ ุ
1
2
3
4
5
การเตรียมพืชสาหรับการส่ งถ่ าย gene
การเตรียม gene (การ clone DNA)
การส่ งถ่ าย gene ให้ กบั พืช
การตรวจสอบการแสดงออกของ gene
การเพิม่ ปริมาณพืชแปลงพันธุ์
การ clone DNA
1. เตรียม DNA พาหะทีบ่ ริสุทธิ์
2. ตัด DNA พาหะทีจ่ ุดจาเพาะด้ วย restriction enzyme
3. เตรียม DNA ที่ต้องการจะ clone แล้ วตัดด้ วย
restriction enzyme ชนิดเดียวกับทีต่ ัด DNA พาหะ
4. สร้ าง DNA ลูกผสม (recombinant DNA ; rDNA)
ในหลอดทดลอง โดยเชื่อมชิ้น DNA พาหะกับชิ้น DNA
ที่ต้องการจะ clone ด้ วยDNA ligase (DNA ligation)
5. เคลือ่ น DNA ลูกผสม (rDNA) เข้ าสู่ เซลล์ ให้ อาศัย
ในหลอดทดลอง
6. คัดเซลล์ ให้ อาศัยที่มี DNA ลูกผสมทีต่ ้ องการ
DNA พาหะ (Vector DNA)
Plasmid เป็ น DNA เกลียวคู่ รู ปวงแหวน พบอยู่ใน bacteria
ใน plasmid จะมีส่วนเริ่มต้ นของการ replication
(origin of replication) ทาให้ สามารถถ่ ายแบบได้ อย่ างอิสระ
นอกจากนี้ plasmid บางชนิดยังมี antibiotic resistant
gene
อยู่ทาให้ เซลล์ ให้ อาศัย (host cell) ที่มี plasmid เหล่ านั้น
อยู่สามารถเจริญได้ ในทีม่ ี antibiotic นั้นๆ
DNA ที่ใช้ ในการ clone
1. Genomic DNA
2. Complementary DNA (cDNA)
3. DNA ที่สังเคราะห์ โดยวิธีทางเคมี
สั งเคราะห์
oligonucleotide ขนาด 100
nucleotide
โดยใช้ เครื่องสั งเคราะห์ อตั โนมัติ
4. DNA ที่ได้ จากการเพิม่ ปริมาณโดย
การส่ งถ่ าย gene ให้ กบั พืช
(การสร้ างพืชดัดแปลงพันธุกรรม)
การส่ งถ่ าย gene เข้ าสู่ พชื ใช้ วธิ ี
1. Agrobacterium mediated gene transfer
2. Direct gene transfer
Agrobacterium
@ เป็ น bacteria แกรมลบชนิด aerobic bacteria
ทีอ่ าศัยอยู่ในดิน
@ เป็ นสิ่ งมีชีวติ ชนิดแรกที่ก่อให้ เกิดการส่ งถ่ ายยีน
ตามธรรมชาติหรือก่ อให้ เกิดพันธุวศิ วกรรม
ตามธรรมชาติ (Nature’s first genetic
engineering)
@ จัดอยู่ใน Family Rhizobiaceae
Agrobacterium ชนิดที่สาคัญคือ
1. A. tumefaciens ก่อให้ เกิดโรค crown gall
2. A. rhizogenes ก่อให้ เกิดโรค hairy root
ภายในเซลล์ Agrobacterium มี extrachromosomal
plasmid ขนาดใหญ่ ประมาณ 200 kbp.
@ ใน A. tumefaciens มี Ti plasmid
(Tumor inducing plasmid)
@ ใน A. rhizogenes มี Ri plasmid
(root inducing plasmid)
Ti plasmid
Ri plasmid
Ti plasmid
บน Ti plasmid จะมี 2 บริเวณที่มีความสาคัญ
ต่ อการส่ งถ่ ายยีนสู่ พชื คือ
1. T-DNA (transfer DNA)
2. Vir region (virulence region)
T-DNA (transfer DNA)
ประกอบด้ วย DNA ประมาณ 23 kb ขอบเขตของ
DNA (DNA border) กาหนดด้ วย terminal repeat
ประมาณ 25 bp ซึ่งเรียกว่ า left border (LB) และ
right border (RB) บริเวณ LB และ RB มีความ
สาคัญ คือทาหน้ าทีเ่ ป็ น
recognition signals for transfer system
# นอกจากนีบ้ น T-DNA มีรหัสสาหรับการสร้ าง
enzyme ทีจ่ าเป็ นสาหรับการสั งเคราะห์ สาร opine,
ออกซินและไซโตไคนิน
# Opine เป็ นแหล่ ง C และ N ที่ Agrobacterium จะนา
ไปใช้ ตัวอย่ างสาร opine เช่ น octopine และ nopaline
แสดงแผนที่ของ T-DNA ของ Agrobacterium
แสดง gene ทีก่ าหนดการสร้ าง auxin และ cytokinin
การเกิด Crown gall
เมื่อ A. tumefaciens บุกรุก (infect) พืชตรงบริเวณที่มีบาดแผล
จะทาให้ เกิด crown gall หรือเนือ้ เยือ่ ปุ่ มปมขึน้ ทีล่ าต้ น
รู ปสรุ ปกระบวน
การส่ งถ่ าย gene
สู่ พชื โดย
Agrobacterium
พืชเกิดบาดแผล
ปลดปล่ อยสารในกลุ่ม pheonolic compound
Agrobacterium เคลือ่ นทีแ่ บบ chemotaxis
Pheonolic cpd. กระตุ้นการทางานของ vir gene
T-DNA สอดแทรกเข้ า Plant genome
Crown gall tumor
การสร้ างพืชแปลงพันธุ์
• มีเวคเตอร์ นา gene ทีส่ นใจเข้ าสู่ พชื
• มีการรวมตัวของ gene และโครโมโซมพืช
• มีการรวมตัวแบบเสถียร สามารถผ่ านขั้นตอน
การแบ่ งเซลล์ ได้
• gene ทีส่ ่ งถ่ ายเข้ าไปถูกถ่ ายทอดได้ โดยการ
แบ่ งเซลล์
การสร้ างพืชแปลงพันธุ์
การใช้ Agrobacterium พา gene ที่ตัดแต่ งเข้ าไปในเซลล์ พชื
โครงสร้ างของยีน (gene construct)
ทีเ่ ป็ นส่ วนประกอบหลักของ GMOs
การส่ งถ่ ายจีน Tobacco mosaic virus เข้ าสู่ พชื โดย Agrobacterium
(Raven and Johnson, 1995)
•
•
•
•
•
•
•
ตัวอย่ างพืชแปลงพันธุ์ทไี่ ด้ จากการใช้
Agrobacterium
kiwifruit
sugarbeet
rapeseed
turnip-rape
Brassica napus
B. juncea
B. oleracea
•
•
•
•
•
•
•
papaya
cucumber
melon
chrysanthmum
carnation
strawberry
soybean
ตัวอย่ างพืชแปลงพันธุ์ทไี่ ด้ จากการใช้
Agrobacterium (2)
•
•
•
•
•
•
•
Cotton
sunflower
walnut
flax
tomato
alfalfa
tobacco
•
•
•
•
•
•
•
Pea
popular
plum
Prunus armeniaca
potato
pepino
grape vine
Direct gene transformation
Polyethylene Glycol
Microprojectile , microprojectile
bombardment, particle gun
Electroporation
Microinjection
Ultrasonication
Microprojectile (Raven et al., 1995)
Microinjection (Raven et al., 1995)
การส่ งถ่ ายจีนทั้งสองวิธี (Raven et al., 1995)
•
•
•
•
•
•
•
•
ตัวอย่ างพืชแปลงพันธุ์ทไี่ ด้ จาก
การส่ งถ่ ายจีนโดยวิธีตรง
Brassica napus (rapeseed)
Brassica oleracea
Dactylis glomerata (cockfoot)
Fragaria x ananassa
(strawberry)
Glycine max (soybean)
Lactuca sativa (lettuce)
Orysa sativa (rice)
Zea mays (maize,corn)
• Festuca arundiancea (tall
fescue)
• Avena sativa (oats)
• Carica papaya (papaya)
• Gossypium hirsutum (cotton)
• Picea glauca (white spruce)
• Populus (poplar)
• Triticum aestivum (wheat)
ประโยชน์ ของการสร้ างพืชแปลงพันธุ์ (GMOs)
1. ทาให้ เกิดพืชสายพันธุ์ใหม่ ทตี่ ้ านทานต่ อโรค เช่ น ต้ านทาน
ต่ อ virus โดยส่ งถ่ าย gene ทีก่ าหนดการสร้ าง coat
protein gene (CP) ของ virus เข้ าไปในพืช
2. ทาให้ เกิดพืชสายพันธุ์ใหม่ ทตี่ ้ านทานต่ อแมลงศัตรู เช่ น ส่ งถ่ า
gene พวก bt gene (Bacillus thuringiensis) เข้ าสู่ พชื
3. สร้ างพืชต้ านทานต่ อสารกาจัดวัชพืชเช่ นต้ านทาน
ต่ อ glyphosate
Herbicide resistance tobacco (Raven et al., 1995)
4. สร้ างพืชพันธุ์ใหม่ ทมี่ ลี กั ษณะทีต่ ้ องการ เช่ น
* สร้ างพืชที่ทนต่ อดินเค็ม
* สร้ างพืชทาให้ คุณค่ าทางอาหารเพิม่ ขึน้ ,
* สร้ างพืชพันธุ์ใหม่ ทสี่ ามารถตรึง N2 ได้
* ดอกไม้ หรือไม้ ประดับสายพันธุ์ใหม่ ทมี่ รี ู ปร่ าง
แปลกกว่ าเดิม ขนาดดอกใหญ่ กว่ าเดิม ถือเป็ น quality trait
5. สร้ างพืชทีส่ ามารถเก็บไว้ ได้ นานโดยไม่ มปี ัญหาเรื่องการสุ ก
ในระหว่ างการขนส่ ง เช่ น สร้ างมะเขือเทศทีส่ ุ กช้ าลงโดยการ
ส่ งถ่ าย gene พวก antisense ACC synthase และ ACC
oxidase ทาให้ ผลิต ethylene ช้ าลง มะเขือเทศสุ กช้ า
สามารถเก็บไว้ ได้ นาน