Savremene metode u molekularnoj genetici

Nove tehnike- novi diskursi

   Najveći deo tehnika otkriven 70-tih i 80-tih godina Načini studiranja – in vivo – in vitro – in sillico In vivo studije obezbedile neka važna otkrića – Mendel: geni su nasledne čestice – Griffith, Avery, MacLeod, McCarty: Geni su DNK – Beadle i Tatum: Geni kodiraju za enzime – Benzer: Geni su segmenti DNK – Jacob i Monod: Geni su regulisani

Nova pitanja- nove tehnike

   Detaljno proučavanje – građe i strukture gena i genoma – kontrole genske ekspresije pored starih tehnika – kontrolisanih ukrštanja – selekcije – analize klasičnih genetičkih (fenotipskih) markera zahteva novi eksperimentalni pristup i nove tehnologije – rekombinantna DNK tehnologija – kloniranje – PCR – minijaturizaciju i multipleksovanje

Preparativne tehnike

Podela tehnika

Analitičke tehnike Izolovanje DNK/RNK Hibridizacija DNK/RNK Centrifugiranje Elektroforeza Enzimska digestija DNK Rekombinovanje DNK Kloniranje DNK Umnožavanje DNK Sekvenciranje DNK Epigenetika

    Nove tehnologije su zasnovane na starim enzimima DNK polimeraze DNK endonukleaze DNK ligaze Terminalne transferaze

DNK polimeraze

  DNK polimeraze su – Zavisne od matrice – Zavisne od prajmera – Multifunkcionalne   3’-5’ egzonukleazna (prufriding, editorska) 5’-3’ egzonukleazna (nik translaciona) Varijante – Kornbergov enzim – Klenow fragment – Sekvenaza (T7) – Taq polimeraza – Reverzna transkriptaza

Nukleaze

 Egzonukleaze  Endonukleaze  S1 nukleaza (ssDNA, RNA)  DNaza I (dsDNA)  Restrikcione endonukleaze  Tip I i Tip III ne seku na tačno određenom mestu

Restrikcione endonukleaze tipII

    Prepoznaju određenu sekvencu (restrikciono mesto) i seku unutar nje ili veoma blizu.

Restrikciono mesto – Jedno GAATTC (EcoRI) – Više sličnih GANTC (HinfI) Više hiljada izolovano, više stotina u komercijalnoj upotrebi Izošizomeri

Krajevi

   Lepljivi (kohezivni) – 5’ overhang – 3’ overhang Tupi (poravnati) Neki enzimi sa različitim restrikcionim mestima daju iste lepljive krajeve (npr. Sau3AI i BamHI daju GATC) Tupi i lepljivi krajevi 5’ i 3’ overhangs Različiti enzimi mogu davati iste krajeve

DNK ligaze

   Najčešće se koristi T4 ligaza In vivo prekidu uloga da restituiše fosfodiestarsku vezu u jednolančanom In vitro lancu.

traba da napravi dve veze, po jednu u svakom

Preparativne tehnike: Izolovanje DNK

 Maceriranje tkiva – mehaničko  Razaranje ćelija – Mehanička liza (sonikacija, smrzavanje, mlevenje) – deterdženti- SDS, – Enzimi - lizozim, proteinaze – Helirajući agensi – EDTA – Redukujući agensi - DTT

Purifikacija DNK

     Rastvaranje organskim rastvaračima (fenol:hloroform:izoamilalkohol 25:24:1) i taloženje u etanolu Precipitacija DNK cetiltrimetilamonijum bromidom-CTAB, resuspenzija solima, digestija RNazom, taloženje etanolom.

Precipitacija DNK na silikatne čestice u haotropnim solima (guanidintiocijanat-GTC) u dva formata (u rastvoru i u koloni) Izolacija helirajućim smolama Izolacija pomoću paramagnetnih čestica

Rekombinantna DNK tehnologija i kloniranje gena

    Šta je to kloniranje?

Zašto kloniramo?

Kombinacija restrikcione digestije i ligacije Dva različita molekula DNK isečena istim enzimom mogu da se ligiraju i da daju novu kombinaciju.

Vektori za kloniranje

 Svojstva dobrih vektora – Oridžin replikacije – Lako se umnožavaju u velikom broju kopija – Neesencijalni geni koji se mogu ukloniti – Bar dva selektabilna markera – Višestruka unikalna Restrikciona mesta

Plazmidni vektori

  pBR322 – Napravljen od tri E.coli plazmida (R1, R6.5, pMB1) – 4363 bp dugačak – Amp i Tet rezistencija – Inserciona inaktivacija rezistencije – Zahteva presađivanje replika pUC – Amp i β gal gen.

pBR322

Kloniranje u pBR322

Kloniranje u pUC

Bakteriofagni vektori

Proteini omotača Integracija Replikacija Liza        Najčešće korišćen fagni vektor je  fag 48.5 kb dugačak genom 15 kb može da se izbaci bez uticaja na infektivnost faga 18 kb može da se ubaci na mesto izbačenog fragmenta Dva tipa  fagnih vektora je razvijeno – Insercioni vektori (deo koji je opcion je izbačen, a na njegovom mestu je polilinker – Replacement vektori (deo koji je opcion je oivičen restrikcionim mestima) Vektori koji koriste sistem za in vitro pakovanje Fagi se u bakteriju ubacuju transfekcijom .

 insercioni vektor R Može da se deletira R R  replacement vektor R R R R

Vektori za duže fragmente DNK

     Kozmidni vektor Ima cos mesta faga i oridžin replikacije plazmida i još par selekcionih markera (ukupna dužina 8 kb) Može da spakuje 44 kb Može da se upakuje u glave faga u in vitro sistemu za pakovanje Ulazi efikasno kao fag, a onda se ponaša kao plazmid (kolonije a ne plake).

Vektori za duže fragmente DNK

Vektor Broj klonova (N) P=95% P=99%  replacement Cosmid, Fosmid P1 BAC, PAC YAC MEGA YAC Veličina inserta (Kb) 18 40 125 300 600 1400 532.500

240.000

77.000

32.000

16.000

6.850

820.000

370.000

118.000

50.000

24.500

10.500

N=ln(1-P)/ln(1-a/b) a prosečna veličina fragmenta b veličina genoma

Važne osobine YAC vektora

 Važne sekvence – Za replikaciju hromozoma    TEL: telomera CEN4 Centromera hromozoma 4 ARS sekvenca za autonomnu replikaciju (slično ori) – Za selekciju rekombinanata   TRP1, URA3: kvaščevi selektabilni markeri SUP4: inserciono inaktiviran marker kod rekombinanata

PCR In vitro kloniranje Molekularno fotokopiranje

Amplifikacija je eksponencijalna. Teorijski, od jedne kopije matrice, u 30 ciklusa amplifikacije dobijamo 2 30 (oko 10 9 ) kopija.

Hibridizacija nukleinskih kiselina

Hibridizacija TaqMan u rastvoru na membrani RNase Protection Assay Southern blott Northern blott in situ FISH Spectral kariotyping

Hibridizacija DNK: RFLP analiza

restrikcija elektroforeza Transfer hibridizacija autoradiografija film