Transcript Предавања: Микробиологија







1892. Ivanovski, filtrabilni uzročnik mozaične bolesti
duvana
1898. Bejerink, potvrdio eksperimente Ivanovskog
1898. Lefler i Froš, filtrabilni uzročnik slinavke i šapa
1909. Landštajner i Poper, filtrabilni uzročnik dečije
paralize
Nazvani virusi – živi otrov
1915. Tvort i 1917. Derel, otkriće bakteriofaga – virusa
koji napadaju bakterije





Najmanji i najjednostavniji
mikroorganizmi
Nemaju ćelijsku građu –
acelularni
Virusna čestica – virion
Ubrajaju se u žive organizme
jer poseduju genetičku
informaciju za sopstvenu
reprodukciju
Na granici veličine
makromolekula (20-300 nm)



Van ćelije metabolički
inertni
Obligatni intracelularni
paraziti - u ćeliji koriste
metabolički aparat (enzime,
ribozome) i energiju
domaćina za sopstvenu
reprodukciju
1 čestica virusa može dati
preko hiljadu novih virusnih
čestica




Nukleinska kiselina (DNK ili
RNK)
Kapsid, proteinske prirode,
izgrađen iz strukturnih
jedinica – kapsomera
Nukleinska kiselina i kapsid
grade nukleokapsid
Kod nekih virusa postoji
dodatni omotač poreklom od
citoplazmatične membrane
domaćina i specifičnih
virusnih proteina

U nukleokapsid mogu biti
upakovani enzimi
neophodni za inicijalne faze
infekcije; sintetišu se i
pakuju u ćeliji prethodnom
domaćinu


DNK ili RNK
jednolančana ili dvolančana, cirkularna ili linearna, neki RNK
genomi su segmentirani
Proteinski omotač – kapsid


Izgrađen od kapsomera
Kubna, spiralna ili kompleksna simetrija
◦ Kompleksna tipična za bakteriofage
◦ Spiralna tipična za biljne viruse
◦ Animalni virusi imaju najveću
varijabilnost u simetriji kapsida
Ikosaedarna
simetrija
papova virus
(dsDNK)
polio virus
(+ssRNK)
Adenovirus
(dsDNK)
Bakteriofag T4
Bakteriofag λ
Bakteriofag Mu


Najčešće animalni virusi,
kubne ili spiralne simetrije
Na površini se uočavaju
šiljci, virusni glikoproteini
Kod influenca virusa:
◦ hemaglutinin (H), vezuje se
za ćelijske receptore
◦ neuraminidaza (N), enzim
koji olakšava oslobađanje iz
ćelije
Influenca virus



DNK virusi
Virusi metanogena i halofila
imaju sličnu morfologiju kao T4
fag i linearnu ds DNK
Virusi hipertermofilnih Archaea
(Sulfolobus, Pyrococcus) imaju
neobičnu morfoligiju i linearnu
ili cirkularnu ds DNK
PAV1
virus hipertermofilne Archaea
roda Pyrococcus, ima kratak rep
DNK virusi hipertermofilnih Archaea
roda Sulfolobus
• Prema domaćinu:
(bakterijski, animalni, biljni i virusi gljiva)
• Prema nukleinskim kiselinama:
• Prema načinu replikacije
Klasifikacija u taksonomske kategorije najviše se koristi kod
animalnih virusa, najčešće do familija, sa nastavkom viridae,
rod ima nastavak virus, a vrsta dobija naziv prema bolesti koju
izaziva.
‘+’ lanac RNK služi kao iRNK
‘-‘ lanac RNK je matrica za sintezu iRNK (komplementaran mu je)
‘+’ lanac DNK je istog smisla kao i iRNK, tj. služi kao matrica za
sintezu – lanca (dvolančana replikativna forma), a onda - lanac
DNK služi kao matrica za sintezu iRNK



Uloga u početnim fazama infekcije
DNK polimeraza ili RNK polimeraza
Reverzna transkriptaza (retrovirusi)
Lizozim (bakteriofagi)
Sintetišu se u prethodnom domaćinu i pakuju u
kapsid




Elektronska mikroskopija (moć razdvajanja 0.4-1
nm) – determinacija morfologije virusnih čestica
(veličina 20-300 nm)
Imunološke metode – reakcije antigen-antitelo
korisne za identifikaciju virusa u ćelijama i tkivima i
za određivanje srodnosti i klasifikaciju virusa
Izolacija nukleinskih kiselina i proteina –
biohemijske metode izučavanja
Izučavanje interakcije virusa i ćelije domaćina



Adsorpcija
Penetracija
Replikacija
◦ sinteza nukleinske kiseline
◦ sinteza proteina kapida


Sazrevanje (maturacija)
Oslobađanje iz ćelije



Adsorpcija na specifične
receptore
Kod bakteriofaga ulazi
nukleinska kiselina
Animalni i biljni virusi
ulaze sa kapsidom
(translokacijom,
endocitozom, fuzijom
membrane sa dodatnim
omotačem virusa, ‘ujedom’
insekata) i nukleinska
kiselina se oslobađa u ćeliji





Pakovanje nukleinske
kiseline u kapsid
Sklapanje kapsida “self
assembly” proces, ponekad
učestvuju šaperoni
Oslobađanje lizom ćelije
Prolaskom kroz
citoplazmatičnu membranu
bez lize
Pupljenjem (virusi sa
omotačem)




Posle adrsorpcije neko
vreme nema zrelih
virusnih čestica – period
eklipse.
Period eklipse traje do
pojave prvih zrelih
virusa u ćeliji
Eklipsa i sazrevanje čine
latentni period
Latentni period traje do
oslobađanja prvih virusa
iz ćelije






T2, T4
λ (lambda)
φX174
M13, fd
MS2 (RNK)
φ6 (segmentirani dsRNK
genom i dodatni omotač,
napada Pseudomonas)
Umereni virusi

Virulentni virusi



Sa domaćinom
isključivo ulaze u
litički ciklus
Rezultat
razmnožavanja po
pravilu je liza ćelije i
oslobađanje velikog
broja fagnih partikula
Na bakterijskom
tepihu daju svetle
plake






Sa domaćinom ulaze u litički ili lizogeni
ciklus
Rezultat litičkog ciklusa je liza ćelije i
oslobađanje velikog br. fagnih partikula
Rezultat lizogenog ciklusa je lizogena
bakterija u kojoj je virus u stanju profaga;
lizogena bakterija se umnožava i svaka ćerka
ćelija u sebi nosi profag (1 kopiju virusne
DNK)
Profag je integrisan u hromozom domaćina
(λ fag) ili je ekstrahromozomalna DNK (P1
fag)
Na bakterijskom tepihu daju mutne plake
Lizogena indukcija – prelazak u litički ciklus
Lizogena konverzija – domaćin stiče nova
svojstva kodirana genima profaga (pr.
Corynebacterium diphteriae)



Genom dvolančana linearna DNK sa terminalnim ponavljanjem,
kodira 250 proteina, kapsid kompleksan, 25 proteina
Kompleksne simetrije: glava izduženi ikosaedar, kontraktilan
repić sa dugim kukicama
Virulentni virus: sa domaćinom stupa u litički ciklus, lizira ćeliju i
oslobađa se oko 100 virusnih čestica



Rani proteini (preko 20): nukleaze (isecaju DNK domaćina), DNK polimeraza,
enzim za sintezu hidroksimetilcitozina, enzim za kovalentnu modifikaciju RNK
polimeraze domaćina, tako da funkcioniše bez σ faktora i drugi
Srednji proteini: novi σ faktori za kasne gene
Kasni proteini: proteini kapsida i lizozim




Replikacija genoma u
linearnoj formi
Formiranje konkatemera
rekombinacijom
(džinovski molekuli
DNK)
Pakovanje u glavu dok
nije puna (staje više od
veličine genoma)
Terminalno ponavljanje
i cirkularna permutacija



Umereni virus, sa domaćinom može ući u lizogeni ili litički
ciklus
Kompleksan kapsid: glava i nekontraktilni rep bez kukica
Genom linearna dvolančana DNK sa jednolančanim
komlementarnim krajevima (12 nukleotida, cos mesta =
‘cohesive sites’), u ćeliji se cirkularizuje
Litički ciklus:
• Faza replikacije virusa
• Faza maturacije virusa
• Liza ćelije i oslobađanje novih viriona
Lizogeni ciklus:
• Virusna DNK je profag integrisan u
hromozom domaćina
• Ćelija je lizogena, imuna na ponovnu
infekciju istim tipom virusa
• Ekspresija virusnog represora CI
sprečava ekspresiju drugih gena i ulazak
u litički ciklus
Lizogena indukcija – prelazak iz
lizogenog u litički ciklus

U početku se sintetišu rani proteini uključeni i u
litički i u lizogeni ciklus
Ključna uloga dva represora
 Cro – represor, blokira sintezu sa promotora PL i
PR kada ga ima dovoljno fag ulazi u litički
ciklus
 CI – represor λ faga, ključan za održavanje
virusa u lizogenom ciklusu
Replikacija DNK virusa


θ replikacija, kasnije
rolling circle
pakovanje isecanjem cos
mesta


Za lizogeni ciklus neophodni proteini Int (integraza, omogućava
ugradnju profaga u hromozom domaćina), CII i CIII, CI.
Potrebno da se sintetiše λ represor (CI) i zaustavi transkripciju
svih gena osim sopstvenog
CI represor λ faga
1.
2.
Stabilno vezan za operatorska mesta virusnih gena
↓
Onemogućena je sinteza proteina neophodnih za litički ciklus
- virus ulazi u lizogeni ciklus.
Ukoliko dođe do ponovne infekcije istorodnim tipom faga,
represor se odmah vezuje za operatorska mesta njegovih gena
i sprečava njihovu ekspresiju, a to znači imunost na ponovnu
infekciju.


Kada se CI represor
sintetiše i veže za
operatorska mesta,
zaustavlja se ekspresija
ranih gena
Pomoću Int proteina
(mesto specifična
nukleaza/integraza) genom
λ se integriše u hromozom,
mehanizmom
rekombinacije specifične
za mesto)


Protein CII je rani protein, neophodan je za sintezu represora
CI i ulazak u lizogeni ciklus.
Njegova stabilnost zavisi od količine ćelijskih proteza koje ga
razgrađuju odmah po sintezi.
Energetsko stanje u ćeliji
dobro,
intenzivan metabolizam
↓
Ima dovoljno proteaza,
nema CII,
nema ni CI represora
↓
Litički ciklus
Energetsko stanje u ćeliji loše,
metabolizam usporen
↓
Nema dovoljno proteaza, CII je
stabilan,
CI represor se sintetiše
↓
Lizogeni ciklus





Izvlačenje profaga iz hromozoma domaćina i prelazak
u litički ciklus, omogućeno razgradnjom λ represora.
Za izvlačenje profaga neophodan je produkt xis gena –
ekscizionaza)
Spontan proces se retko dešava, ali je moguće
indukovati ga agensima koji oštećuju DNK (UV, X, γ
zračenje, hemijski mutageni).
U slučaju oštećenja DNK dolazi do indukcije SOS
odgovora. Jedna od manifestacija je i razgranja
represora koji drže zaključane SOS gene, ali i CI
represora λ faga.
Skidanje CI represora ima za posledicu otključavanje
litičkih gena faga, tj. prelazak u litički ciklus.




Cirkularna + ss-DNK, ~ 5400
nt
Geni koji se preklapaju
(‘overlapping genes’),
fenomen početka translacije
sa različitih mesta i iz
različitih okvira čitanja istog
nukleotidnog zapisa
kodirano 11 proteina,
Ikosaedarni kapsid, 60
kapsomera (25 nm veličine)





Replikacija zavisna od
enzima domaćina
Replikativna ds forma,
teta replikacija
Transkripcija minus lanca
daje policistronske iRNK
Formiranje genoma replikacija po tipu
kotrljajućeg obruča
Pakovanje i oslobađanje
lizom ćelije





Cirkularna + ss-DNK
Filamentozni fagi
Adsorbuju se na seks pilus (F+
ćelije E. coli su domaćini)
Pakovanje u kapsid pri izlasku
iz ćelije (pupljenjem, ne ubija
ćeliju domaćina)
Nema lize ćelija – nema plaka,
već prosvetljenja na tepihu
bakterija
Pogonosti:
 ssDNK virus → lako sekvenciranje
 Ima dsDNK oblik (replikativna forma) neophodan za
kloniranje
 Inficirane ćelije se održavaju u životu, virus ih ne lizira, tako
da mogu biti kontinuirani izvor klonirane DNK
 Intergenski prostor koji ne kodira proteine i koji se može
zameniti stranom DNK je dovoljno veliki
Bakteriofag MS2





Ikosaedarni kapsid (25 nm)
+ ss RNK genom od 3569
nt
Geni koji se preklapaju
kodiraju 4 proteina: RNK
replikazu (deo), protein
kapsida, maturacioni
protein i protein za lizu
ćelije domaćina
Adsorbuje se na seks pilus
F+ ćelije E.coli
RNK se koristi kao iRNK
φ6 bakteriofag
 Segmentirani dvolančani
RNK genom
 Parazitira na Pseudomonas
syringae


Dva ili više virusa inficiraju jednu ćeliju
Tokom mešovite infekcije mutantnim virusima iste
vrste moguća je:
◦ rekombinacija
◦ komplementacija
T4 fag raste na E. coli C i K12 linijama. Mutanti u lokusu rII
ne rastu na E.coli K12.
U mešovitoj infekciji rastu na E.coli K12.
Fagi iz pojedinačne plake:
ne rastu na E.coli K12 – komplementacija
rastu na E.coli K12 - rekombinacija



Bakterije sintetišu enzime - restrikcione endonukleaze
Seku dvolančanu DNK virusa (stranu DNK) na
specifičnim sekvencama (ssDNK i RNK virusi nisu
osetljivi)
Bakterijska DNK je modifikovana i nije osetljiva na
sopstvene restrikcione enzime

Bakterije poseduju specifične restrikciono-modifikacione
sisteme (npr. E.coli linije K i B, E. coli C nema
restrikciono-modifikacioni sistem)

Virusi se brane od restrikcionih endonukleaza
metilacijom ili glikozilacijom svoje DNK, tj. istim tipom
modifikacije koji postoji u DNK domaćina.
Npr. T4 fag: modifikacija citozina u 5-hidroksimetil
citozin
