Transcript Предавања: Микробиологија

Virusi eukariota
Animalni i biljni virusi
Eukariotska ćelija



Prostorna razdvojenost
replikacije i transkripcije
(jedro) i translacije
(citoplazma)
Nepostojanje policistronskih
iRNK
Kod biljaka postojanje čvrstog
ćelijskog zida
Virusi eukariota su morali
tokom evolucije da se prilagode
ovakvim svojstvima svojih
domaćina.
Animalni virusi

DNK virusi se repliciraju u jedru (koriste domaćinovu DNK
polimerazu), izuzetak Pox virus, koji nosi u virionu sopstvenu
DNK polimerazu

RNK virusi se repliciraju u citoplazmi, izuzetak Influenza virus
kod koga se replikacija RNK odvija u nukleusu
Kod +RNK virusa posebni proteini se transkribuju:
o
o
kao poliprotein koji se kasnije iseca (Poliovirus)
sa +RNK translatira se samo RNK replikaza, koja najpre omogućava
sintezu -RNK, a zatim se sa nje transkribuju monocistronske iRNK (Corona
virus)
-RNK virusi
transkribuju:
o
o
nose
RNK
replikazu;
posebni
proteini
se
RNK replikaza transkribuje monocistronske iRNK sa -RNK (Rhabdovirus)
RNK replikaza transkribuje sa segmentiranih -RNK nekoliko iRNK
(Influenca virus)
Picornavirus (Poliovirus)







Izazivač poliomijelitisa
Kapsid ikosaedarne simetrije oko 30
nm
Genom +RNK, na 5’ kraju VPg protein
(sa petljama RNK imitira kompleks za
formiranje 5’ kape), na 3’ kraju poliA
rep
Ceo proces replikacije virusa u
citoplazmi
Translacijom nastaje poliprotein koji
podleže samoisecanju i nastaju: RNK
replikaza, VPg protein, proteaza i
strukturni proteini kapsida
RNK replikaza sintetiše – RNK sa koje
sintetiše +RNK, finalno oko 1.000.000
kopija, koje se kombinuju sa
kapsomerama
Proteaza razgrađuje “cap-binding”
protein domaćina, čime inhibira
translaciju proteina domaćina
Coronavirus (SARS)






Veliki virusi (do 200 nm), sa
omotačem i spajkovima koji grade
koronu (venac, kruna)
Kompletna replikacija u
citoplazmi
Genom +RNK, oko 30 kb sadrži
5’ kapu i 3’ poliA rep
Sa genomske RNK translatira se
najpre samo RNK replikaza koja
sintetiše – RNK lanac
Sa –RNK se transkribuju
monocistronske iRNK za virusne
proteine i sintetiše +RNK pune
dužine (genom)
Sazrevanje se vrši u Goldži
aparatu i virioni se oslobađaju sa
površine ćelije
Rhabdovirusi (virus besnila)






Virion u obliku metka (70x175 nm)
spiralna simetrija kapsida, dodatni
omotač
Mali –RNK genom
Virion nosi RNK zavisnu RNK
polimerazu koja transkribuje dve vrste
RNK: nekoliko iRNK i genomsku
+RNK
Proteini kapsida se kombinuju sa -RNK
Glikoproteini virusa se ugrađuju u
citoplazmatičnu membranu
Virus napušta ćeliju pupljenjem i ponese
omotač
Orthomyxovirusi (Influenza virus)









Segmentiran genom, osam -RNK molekula
Spiralna simetrija kapsida, dodatni omotač daje
polimorfan oblik
Jedini RNK virus koji se replicira u nukleusu,
posle dekapsidacije RNK migrira u nukleus
Virion nosi RNK zavisnu RNK polimerazu i
RNK endonukleazu (iseca 5’ krajeve prekursora
ćelijskih iRNK koji već sadrže kapu)
Replikacija genoma slična rabdovirusima. iRNK
se sintetišu koristeći kao prajmere isečene 5’
krajeve ćelijskih iRNK sa kapama. Na iRNK se
dodaju i poliA repovi.
Translacija u citoplazmi, sinteza10 proteina
Pakovanje u citoplazmi, pupljenje
Česta promenljivost pri mešovitoj infekciji
(‘antigenic shift’): razlog – segmentiran genom
‘Antigenic drift’ – izmene antigenih determinanti
usled mutacija
‘Antigenic shift + drift’
razlog što se svake godine
pravi nova vakcina protiv
gripa
Reovirusi (Rotavirus)









Najčešći uzročnik diareje kod beba
Ikosaedarni dupli kapsid, 60-80 nm
Genom od 10-12 molekula linearne dsRNK
U virionu je spakovana RNK replikaza i drugi neophodni enzimi
Ulaze endocitozom, transportuju se u lizozom
U lizozomu se gubi spoljašnji kapsid i čestica sa oslobađa u citoplazmu gde
dolazi do replikacije RNK unutar “subvirusnih čestica”
Pomoću RNK replikaze sa -RNK sintetišu se iRNK, dodaju se 5’ kape i 3’
poliA repovi pomoću virusnih enzima i dolazi do translacije virusnih
proteina u citoplazmi
RNK replikaza sa +RNK sintetiše komplementarne – RNK, nastaje dsRNK
genom
Sazrevanje i oslobađanje lizom ćelije
Dvolančani DNK virusi





Polioma virusi (SV40) ikosaedarne simetrije (45 nm) sa cirkularnom
superspiralizovanom DNK, koja se replicira teta replikacijom pomoću
DNK polimeraze domaćina. Indukuju tumore kod životinja.
Papiloma virusi, uzrokuju bradavice i kondilome, neki tipovi indukuju
kancer grlića materice.
Herpes virusi (herpes, genitalni herpes, herpes zoster i ovčije boginje),
Epstein-Barr virus (virus mononukleoze, indukuje tumore – Burkitov
limfom) i citomegalovirus (CMV).
Pox virusi (velike boginje, kravlje boginje), veliki virusi sa linearnom
DNK, jedini koji se repliciraju u citoplazmi.
Adenovirusi, ikosaedarne simetrije sa linearnom DNK (36 kbp), sa 5’
vezanim terminalnim proteinom, sadrži invertovane ponovke na krajevima.
Lanci se repliciraju različito, jedan kao linearan, drugi kao cirkularan
pomoću DNK polimeraze kodirane virusom. Izazivaju blage respiratorne
infekcije.






Herpes simplex virus
Virion 150 nm, sa omotačem i
amorfnim slojem između
nukleokapsida i omotača.
Ulazi fuzijom omotača sa membranom,
nukleokapsid se transportuje u nukleus
DNK linearna, preko 150 kbp,
cirkularizuje se posle infekcije
Sintezu ranih (“immediate early”)
iRNK vrši RNK polimeraza domaćina,
sa njih se sintetišu rani proteini
(regulatorni) koji omogućavaju
ekspresiju gena za srednje, “delayed
early”proteine (proteini replikacije,
uključuju virusnu DNK polimerazu) i
gena za kasne proteine (proteini
kapsida)
Replikacija po tipu kotrljajućeg obruča,
konkatemeri se isecaju na pojedinačne
genome
Sazrevanje u nukleusu, omotač
poreklom od unutrašnje membrane
jedra, oslobađanje kroz ER
Pox virusi (vakcinija virus)









Među najkompleksnijim i najvećim
animalnim virusima (400 x 240 x 200 nm)
Nukleokapsid, 2 lateralna tela i oko njih
omotač od tubularnog proteina
Linearan DNK genom, 185 kbp,
jedinstven po tome što su lanci
međusobno kovalentno povezani na
krajevima
Ulaze endocitozom
Virion sadrži RNK polimerazu koja
transkribuje iRNK za protein
dekapsidacije
Nakon dekapsidacije nastaju tzv.
inkluziona tela u citoplazmi u kojima se
virus replicira i sazreva
Jedini DNK virusi koji se repliciraju u
citoplazmi pomoću sopstvene DNK
polimeraze
Svako inkluziono telo je poreklom od 1
virusa
Oslobađanje dezintegracijom ćelije
Retrovirusi




izazivači AIDS-a i nekih oblika kancera (spadaju u grupu onkogenih
virusa)
poseduju višeslojan dodatni omotač (spoljašnji omotač ‘coat’ i
unutrašnji ‘core’), nose u virionu proteine (enzimski: reverzna
transkriptaza – prepisivanje RNK u DNK, DNK
endonukleaza/integraza, proteaza) i specifični tRNK (služi kao
prajmer za reverznu transkriptazu)
genom 2 identična ssRNK
životni ciklus:






ulazak fuzijom sa membranom domaćina
uklanjanje spoljašnjeg omotača – ‘uncoating’
reverzna transkripcija 1 RNK lanca u RNK:DNK hibrid, pa sinteza dsDNK
ulazak dsDNK u nukleus i integracija u genom domaćina (provirus)
transkripcija provirusa u iRNK i genomsku RNK virusa (za pakovanje u kapsid)
sazrevanje virusa i oslobađanje pupljenjem
Retrovirusi
Hepadna virusi (Hepatitis B virus)






Mali virusi nepravilne štapićaste forme,
sa omotačem
Mali genom (3-4 kb), sadrži gene koji se
preklapaju
DNK cirkularna, parcijalno dvolančana,
kompletira se posle infekcije
DNK polimeraza/reverzna transkriptaza
je spakovana u virionu, služi još i kao
proteinski prajmer za sintezu DNK
Replicira se u nukleusu pomoću RNK
polimeraze domaćina
Nastala RNK sa terminalnim
ponavljanjem se kopira u parcijalno
dvolančanu DNK pomoću reverzne
transkriptaze
Posledice infekcije animalnih ćelija
virusom




Litička infekcija
Perzistentna infekcija
Latentna infekcija
Transformacija ćelija
 onkogeni
virusi (DNK
virusi)
 virusni proteini imaju
onkogeni potencijal
Biljni virusi






Većinom +RNK virusi spiralne simetrije (TMV)
DNK virusi (gemini virus, virus mozaične bolesti karfiola,
Chlorella virusi, fikovirusi)
Virus mozaične bolesti karfiola koristi reverznu transkripciju
tokom replikacije
Mogu se prenositi iz jedne ćelije u drugu kroz plazmodezme
Česti su virusi sateliti, defektni virusi (TNV + TNSV)
Postoje virusi sa podeljenim genomom: virus deteline ima 4
RNK molekula spakovana u 3 kapsida i neophodna je združena
infekcija
Virus mozaične bolesti duvana TMV





Genom je jednolančana +RNK koja kodira 4 proteina i ima 5’
kapu i 3’ petlju nalik tRNK
MTH enzim – metil transferaza (caping protein) i RNK helikaza
RNP gen kodira RNK replikazu (sintetiše se kao deo MTH-RNP
poliproteina, redak događaj)
MP – “protein za kretanje”, omogućava transfer virusne +RNK
kroz plazmodezme (iRNK se sintetiše sa -RNK)
CP - protein kapsida (iRNK se sintetiše sa -RNK)
Mimi virus





Smatrao se doskora najvećim virusom,
srodan biljnim DNK virusima
(fikovirusi) i Pox virusima
Ikosaedarni kapsid sa filamentoznim
nastavcima 390+120 nm u prečniku,
ispod dvoslojna lipidna membrana,
sadrži mRNK za DNK polimerazu
Genom dsDNK 1,2 Mbp
Parazitira na amebi Acanthamoeba
polyphaga, a postoje indicije da
prouzrokuje pneumoniu kod ljudi
(animalni ili biljni virus !?)
Danas najveći Megavirus chilensis
(dimenzije 44o+75 nm u prečniku),
srodan Mimi virusu
Mimi virus
Megavirus
Subvirusne infektivne čestice - viroidi






Kratke nekodirajuće jednolančane
cirkularne RNK (243 - 399 nt) sa
ekstenzivnim komplementarnim
sparivanjem
Izazivaju bolesti kokosa,
krompira, limuna, hrizantema
Ulaze kroz povredu, nema
receptora
U ćeliji koriste RNK polimerazu
domaćina za replikaciju
Kreću se kroz plazmodezme
Utiču na rast biljke, verovatno kao
male regulatorne RNK
Subvirusne infektivne čestice - prioni






Infektivni proteini
Izazivaju spongiformne encefalopatije –
degenerativne bolesti CNS čoveka i životinja
(scrapie, bolest ludih krava, kuru, KJD)
Zahvaljujući konformaciji (β ploče)
ekstremno otporni na denaturaciju i proteaze
U neuronima se sintetišu normalni prion
proteini PrPc koji u interakciji sa infektivnim
pronima menjaju konformaciju u PrPSc, prave
agregacije i talože se
Kod sporadičnih prionskih bolesti nema
infekcije već se radi o slučajnom pogrešnom
savijanju PrPc proteina (u oblik PrPSc)
Kod naslednih prionskih bolesti PrPc gen je
mutiran i pogrešno se savija (u oblik PrPSc)
Promenljivost
mikroorganizama
Promenljivost mikroorganizama

Može biti fenotipska ili genotipska
Genotip – skup svih genetičkih informacija
sadržanih u genomu ćelije (organizma)
 Fenotip - skup vidljivih (strukturnih i
fizioloških) osobina ćelije i rezultat je
interakcije spoljašnje sredine sa genotipom

Fenotipska i genotipska promenljivost
Fenotipska promenljivost – adaptacija na
uslove u kojima se jedinke nalaze, zahvata sve
jedinke u populaciji, ne nasleđuje se.
 Genotipska promenljivost – promena u
genotipu, zahvata retke jedinke u populaciji i
nasleđuje se.
 Postojanje genetičke varijabilnosti u populaciji
je neophodno za adaptaciju na izmenjene
uslove sredine, opstanak i evoluciju živih
organizama.

Mehanizmi genotipske promenljivosti
Mutacije – promene u broju i redosledu
nukleotida u molekulu DNK
 Rekombinacije – stvaranje nove kombinacije
gena; kod bakterija prenosom dela genetičke
informacije iz jedne ćelije u drugu (horizontalni
transfer gena)
 Transpozicije – premeštanje jednog ili više
gena sa jednog mesta na drugo ili sa jednog
replikona na drugi

Mutacije




Promene u broju ili redosledu nukleotida u
molekulu DNK
Obično imaju za posledicu izmenu redosleda
amino kiselina u proteinu koji postaje
nefunkcionalan
Mutacije su redak i slučajan događaj i uglavnom
imaju negativan efekat
Mali broj mutacija omogućava evolutivne
promene
Tipovi mutacija






Tačkaste mutacije (zamene baza i promene okvira
čitanja)
Delecije (gubitak različitog broja baznih parova)
Adicije (dodavanje različitog broja baznih parova)
Insercije (adicija većeg broja baznih parova)
Inverzije (deo DNK se iseca i umeće u obrnutom
smeru)
Duplikacije (oblik adicija kod kojih su dodati nizovi
baza identični)
Zamene baza i efekat na funkciju proteina
Vanfazne - frameshift mutacije
Reverzije
Mutacije koje uspostavljaju fenotip divljeg soja
reverzije – nova mutacija je na istom mestu gde i
prethodna (restaurira se izvorni genotip)
 Supresije – nova mutacija je na drugom mestu ali poništava
efekat prethodne
 Intragenske supresije – nova mutacija u istom genu, npr.
frameshift
 Intergenske supresije – nova mutacija u drugom genu,
npr. supresija nonsense mutacije pomoću supresorskih
tRNK
 Prave
Spontane mutacije



Greške u replikaciji izazvane tautomerijom baza
“Proklizavanje” DNK Pol III na monotonim nizovima
nukleotida
Replikacija ili reparacija koja greši endogenih oštećenja DNK
(oksidativna oštećenja, depurinacija, itd)

Glavni mehanizmi u ćeliji koji kontrolišu nivo spontanih
mutacija:
Selekcija baza i editorska funkcija DNK Pol III
Reparacija pogrešno sparenih baza – MMR

Redak događaj, u proseku 10-10 nukleotida

Indukovane mutacije





Izazvane brojnim hemijskim, fizičkim i biološkim
agensima, mutagenima, koji mogu izazvati različita
oštećenja u molekulu DNK i povećati stopu mutacija
Glavni mehanizmi nastanka indukovanih mutacija:
Zamena purinske ili pirimidinske baze (bazni analozi)
Hemijska promena baze koja izaziva pogrešno
sparivanje (alkilacija, oksidativna deaminacija)
Interkalacija (EtBr, akridin oranž)
Hemijska promena baze koja izaziva potpuni gubitak
sposobnosti sparivanja (pirimidinski dimeri, adukti)
Mutagen
Dejstvo
Tip mutacija
Bazni analozi
5-Bromouracil
2-aminopurin
Analog T, sparuje se sa G
Analog A, sparuje se sa C
AT→GC, GC →AT
AT→GC, GC →AT
Modifikacija baza
Azotasta kiselina HNO2
Hidroksilamin NH20H
Deaminacija A u H i C u U
Reaguje sa C
AT→GC i GC →AT
GC →AT
Alkilirajući agensi
Etil metan sulfonat EMS
Mitomicin C
Metiluje G (G me-T)
Povezuju lance u dsDNK
GC →AT
Tačakste, delecije
Ubacuju se između 2 bp
Male insercije i delecije
Formiranje dimera pirimidina
Slobodni radikali, prekidi
lanaca
U toku ispravke može doći
do tačkastih mutacija ili
delecija
Interkalirajući agensi
Akridini
Etidijum bromid EtBr
Zračenja
Ultravioletno UV-254 nm
Jonizujuća (X-)
Fiksacija mutacija




Proces od nastanka oštećenja do nastanka mutacije
Potrebne dve replikacije za fiksaciju mutacija
U prvoj replikaciji dolazi do ugrađivanja
nekomplementarnog nukleotida u novi lanac DNK
U drugoj replikaciji dolazi do kopiranja templeta sa
pogrešnim nukleotidom i stvara se mutirana DNK
Posledice delovanja mutagena




Smrt ćelije
Ispravka oštećenja reparacionim mehanizmima koji
ne greše
Replikacija oštećenja ili ispravka oštećenja
reparacionim mehanizmima koji greše - indukcija
mutacija
Manje od 1/1000 oštećenja će biti fiksirano u
mutaciju
Mutanti
Jedinke kod kojih je došlo do mutacija i
koje se fenotipski razlikuju od roditelja





Mutanti u morfologiji
Mutanti u ishrani (auksotrofi)
Mutanti rezistentni na antibiotike
Mutanti u reparaciji DNK
Uslovni mutantu
Izolovanje auksotrofnih mutanata tehnikom
kopiranja
Fenotip
Vrsta promene
Detekcija mutanata
Auksotrofi
Odsustvo biosintetičkih puteva
Ne rastu na MM
Osetljivi na
temperaturu
Promene u proteinima koji se
inaktiviraju na određenoj temp.
Ne rastu na temperaturama na
kojima roditelji rastu
Rezistentni na
antibiotike
Izmenjena propustljivost, izmenjeno
mesto vezivanja ili razgradnja
antibiotika
Rastu na antibiotskim
podlogama
Bez kapsule ili LPS
Odsustvo enzima za sintezu kapsule ili
LPS
Male, grube (rough) i
nepravilne kolonije
Gubitak flagela,
nepokretni
Odsustvo enzima za sintezu flagelina
Kompaktne kolonije
Gubitak pigmenta
Odsustvo enzima za sintezu pigmenata
Kolonije su drukčije boje ili
bezbojne
Ne fermentišu šećere
Odsustvo enzima za razgradnju šećera
Ne menaju pH podloge i boju
indikatora
Osetljivi na
mutagene
Odsustvo enzima za reparaciju DNK
Ne rastu na podlogama koje
sadrže mutagen
Rezistentni na viruse
Gubitak receptora za viruse
Rastu u prisustvu virusa
Ames-ov test za detekciju mutagena




Reverzni test na bakteriji S.
typhimurium (prati reverzne
mutacije)
Auksotrofni mutanti u
histidinskom operonu
Reverzije his-→His+ (bazne
zamene i frameshift-i)
Mutacije se prate na minimalnim
podlogama jer na njima rastu samo
reverzni mutanti (His+)
Bruce Ames
“Spot” test
Na površinu agara sa
bakterijama postavljaju se filter
papiri natopljeni supstancom
koja se testira
 Ukoliko je supstanca
mutagena oko natoplenog
papira će se pojaviti revertanti u
većem broju nego oko
kontrolnog filter papira
 Omogućava i testiranje
toksičnosti potencijalnog
mutagena

“Plate incorporation” test
Testirana supstanca i bakterije se
dodaju u soft agar i smeša se
razliva na površinu petri šolje
 Na kontroloj petri šolji se umesto
testirane supstance dodaje rastvarač
 Ukoliko je supstanca mutagena
postojaće razlika u broju kolonija
revertanata u kontrolnoj i test petri
šolji
