Slide 1

Genetički inženjering-tehnologija
rekombinantne DNK


Slide 2

OSNOVE MOLEKULARNE GENETIKE
genom
ćelija
hromozomi

geni
Geni sadrže instrukcije
za stvaranje proteina
DNK

proteini

Proteini deluju
pojedinačno ili
udruženo u kompleksu
u obavljanju različitih
ćelijuskih funkcija


Slide 3

Nove tehnologije






Genetičko
inženjerstvo
(tehnologija
rekombinovane DNK)
Predstavlja sintezu molekularne genetike,
biohemije i mikrobiologije.
Rekombinovana DNK predstavlja mol DNK čiji
se delovi dobijeni iz različitih organizama
veštački spajaju. Na taj način dobijaju se
hibridni organizmi koji se nikada ne bi pronašli
u prirodi.


Slide 4

Nove tehnologije
Tehnologija rekombinantne DNK obuhvata
veći broj tehnika:







Upotreba restrikcionih endonukleaza
(enzima)
Kloniranje DNK (PCR)
Hibridizacija nukleinskih kiselina
Sekvencioniranje nukleotida
Genetičko inženjerstvo


Slide 5

Restrikcioni enzimi

Restrikcioni enzimi deluju kao “molekulske makaze”
Prvi restrikcioni enzimi otkriveni su kod bakterija i imali su
ulogu da “pobede” viruse seckajući njihove gene.


Slide 6

Restrikcioni enzimi
Nizovi nukleotida
koji prepoznaju
enzimi (restrikciona
mesta) su najčešće
PALINDROMI.
To su dvostruko
simetrični nizovi
nukleotida u
dvočlanoj DNK .
Danas je
komercijalno
dostupno oko 200
restrikcionih
enzima.


Slide 7

Kloniranje DNK


Tehnike koje se koriste za izolovanje
pojedinih gena iz hromozoma i njihovo
ugrađivanje u mol DNK, koji se mogu uneti
u ćeliju u kojoj će se autonomno replikovati
umnožavajući ispitivani gen, poznate su kao
KLONIRANJE


Slide 8

Kloniranje
• Kloniranje podrazumeva umnožavanje-dobijanje velikog broja
gotovo istovetnih kopija
•Donedavno ovaj termin je podrazumevao proceduru u kojoj se
reprodukcijom jedne ćelije izolovane iz populacije ćelija, dobijao
klon, odnosno skup gotovo identičnih ćelija.


Slide 9

Kloniranje

1.

2.

3.

4.

Kloniranje jednog segmenta DNK obuhvata
sledeći niz postupaka:
Isecanje željenog fragmenta DNK iz molekula DNK
uz pomoć enzima (restrikcione endonukleaze)
koji će preseći mol DNK na tačno određenom
mestu.
Spajanje dobijenog fragmenta DNK sa malim mol
DNK koji ima sposobnost autonomne replikacije
(vektori za kloniranje-plazmidi ili virusne DNK).
Spajanje fragmenata DNK sa vektorom postiže se
pomoću enzima DNK ligaze.
Unošenje rekombinovanog mol DNK u ćeliju
domaćina čiji će enzimi obezbediti njihovu
replikaciju – umnožavanje.
Indentifikacija ćelije domaćina u kojoj se nalazi
ispitivani fragment DNK i njegovo izolovanje.


Slide 10

Transfer i kloniranje (umnožavanje) insulin gena






Kloniranje genaizdvajanje gena DNK
davaoca, njegovo
umetanje u vektore
(prenosioce) i
ugrađivanje u
organizam domaćina
pomoću metoda
genetskog inženjeringa.
Gen davaoca može da
se umnožu u velikom
broju kopija u
organizmu domaćina.
Kloniranje gena
omogućava proizvodnju
neograničene kolićine
proteina.


Slide 11

Tehnike direktnog unošenja DNK




Elektroporacija- stvaranje privremenih pora u
plazmalemi korišćenjem električnih impulsa.
Fragmenti DNK (geni) kroz pore u plazmalemi
ulaze u ćeliju domaćina.
Genetički pištolj- Male čestice plemenitih metala
prekrivaju se odabranim genom i pomoću
genetičkog pištolja unose se u dublje slojeve ćelije
ili tkiva.


Slide 12



Mikroinjektiranje – uz pomoć mikropipeta vrlo
malog prečnika (0.05-0.10 µm) unose se geni u
jedro ćelije.


Slide 13

Kloniranje









Kloniranje animalnih ćelija danas je gotovo rutina
Ovakav vid kloniranja omogućio je:
perspektive za terapiju i lečenje naslednih bolesti
ispitivanje funkcije pojedinih gena
indentifikaciju regulatornih regiona koji kontrolišu
ekspresiju gena
proizvodnju proteina koji se koriste u biotehnološkoj
industriji i farmaciji
dobijanje transgenih životinja


Slide 14

Kloniranje – danas

Reproduktivna tehnologija za produkciju
genetički indentičnih individua.
Klonalne linije: Populacije individua koje su
genetički ekvivalentne.


Slide 15

Postupak kloniranja sisara


Slide 16

KLONIRANJE KRAVA


Slide 17

Postupak transplantacije jedra


Slide 18

jedro

U jajnu ćeliju sisara naslonjenu na tupu pipetu (levo)
unosi se genetički materijal (jedro) diploidne ćelije
tankom pipetom (desno)


Slide 19

“Dolly”






Škotska ovca – klonirana iz tkiva
mlečne žlezde odrasle individue.
Pre nego što je nastala, naučnici su
verovali da klonovi mogu biti
produkovani samo iz
nediferenciranog embronalnog
tkiva.
Nastala je iz 276 pokušaja kloniranja


Slide 20

Dolly, prva klonirana ovca


Slide 21

`` Polly``



Istraživacki tim koji je stvorio ovcu Dolly
objavio je rodjenje druge klonirane ovce
Polly koja je u svojoj genetskoj šifri
imala prilagodjeni humani gen koji je
ugradjen u fetus ovce u labaratorijskim
uslovima.


Slide 22

Cookies and Cream, su dve klonirane krave Holstein rase.
Dobile su zdrave potomke – muškog i ženskog pola na privatnoj
farmi Infigen u SAD. To je farma sa najvećim brojem (165)
kloniranih krava i ovaca.


Slide 23

Kloniranje
flourescentne mačke (2007)




Naučni tim sa
južnokorejskog Univerziteta
Gjeongsang promenio je
gen odgovoran za boju kože
mačaka.
Zbog flourescentnog
proteina u njihovim ćelijama
kože, mačke s tom
modifikacijom pod UV
svetlom izgledaju
crvenkasto.


Slide 24

Lančana reakcija polimeraze (PCR)


Metod za kloniranje (umnožavanje) DNK

•

K. Mullis – 1983.

•

Osnovni princip PCR amplifikacije željenog
segmenta DNK je oponašanje procesa DNK
replikacije.


Slide 25

PCR

1.

2.

3.
4.

Za primenu PCR neophodni su:
DNK matrica (jednočlana DNK –denaturisani
dupleks DNK)
Prajmer – kratke sekvence DNK sastavljene od 20tak nukleotida koje služe za određivanje početka
umnožavanja fragmenta DNK koga želimo da
izolujemo. Na taj način počinje proces polimerizacije
na tačno određenoj sekvenci DNK određenoj sa 2
prajmera, na svakom kraju po jedan (3’ i 5’).
Nukleotidi – gradivni blokovi
Enzim – DNK polimeraza – koristi DNK matricu za
sintezu komplementarnog DNK lanca


Slide 26

PCR- DNA xeroxing
Matrica
Prajmeri
Nukleotidi

DNK polimeraza


Slide 27

PCR
PCR- faze
 Denaturacija – (90-95°C)
Raskidanje vodoničnih veza između dva
komplementarna lanca DNK pod uticajem
temperature
 Hibridizacija – (45-65°C)
Uspostavljanje vodoničnih veza i vezivanje prajmera
za razdvojene lance DNK
 Elongacija (ampifikacija) prajmera – (72-75°C)
Dobijanje velikog broja kopija željenog fragmenta pod
dejstvom enzima DNK polimeraze.


Slide 28

Denaturacija


Slide 29

Hibridizacija i ekstenzija


Slide 30

Hibridizacija nukleinskih kiselina

denaturacija

hibridizacija

detekcija


Slide 31

PCR analiza


Slide 32

DNK polimeraza






Taq polimeraza
Termostabilana DNK polimeraza, dobijena iz
termofilnih bakterija, ne razgrađuje se na visokoj
temperaturi.
Taq polimeraza omogućila je automatizaciju procesa
PCR u posebnim aparatima (Thermal cycler). Ciklus
polimerizacije ponavlja se 25-45 puta.
Na ovaj način dobija se željena sekvenca DNK u
velikom broju primeraka (približno 228, preko milijardu
kopija) koja se dalje analizira da bi se odredila
primarna struktura gena.


Slide 33

PCR je ciklična reakcija u kojoj se ponavljaju tri koraka:
denaturacija, hibridizacija i elongacija. Na kraju trećeg ciklusa
željena sekvenca je umnožena 8 puta.


Slide 34

PCR




Uspešnost
PCR
reakcije proverava se
elekroforezom
Elekroforeza
predstavlja metod u
kojem se na posebnim
gelovima od skroba,
agara ili poliakrilamida
uz
pomoć
struje
konstantnog intenziteta
(5V/cm) vrši razdvajanje
i vizuelizacija kretanja
nukleinskih kiselina i
proteina.

Slika 1. Određivanje varijanti A
i B u genu za  -kazein
primenom PCR-RFLP metode


Slide 35

PCR


Slide 36

PCR






U određenim slučajevima
za analizu amplifikovanog
segmenta neophodno je
uraditi i dodatne
procedure kao što su:
HIBRIDIZACIJA (Souther
blot)
DIGESTIJA
RESTRIKCIONIM
ENZIMIMA
SEKVENCIONIRANJE


Slide 37

SEKVENCIONIRANJE


Metod relativno
jednostavnog i
brzog određivanja
redosleda
nukleotida u DNK
(primarna struktura)
uz pomoć posebnog
i vrlo skupog
aparataSEKVENCER


Slide 38

Princip rada DNK sekvenatora


Slide 39

DNK biblioteka






DNK biblioteka predstavlja kompletan genom
nekog organizma u vidu fragmenata različitih
dužina dobijenih u postupku kloniranja.
DNK BIBLIOTEKA-GENOMSKA BIBLIOTEKA u
idealnom slučaju sadrži sve delove genoma
jednog organizma.
Da bi se skratio postupak kloniranja nekog
gena danas se konstruišu biblioteke u kojoj su
zastupljeni samo geni i delovi gena koji
kodiraju proteine. Ovakav način kloniranja
podrazumeva da se iz ispitivanog tkiva izoluju
ukupne iRNK koje će poslužiti za sintezu
komplementarnih DNK (cDNK).


Slide 40

Korist i rizici kloniranja


Korist:
– Povećanje genetske vrednosti individua
– Povećanje uniformnosti velikog broja osobina



Rizik:
– Smanjenje genetičke varijabilnosti
– Povećanje inbridinga
– Mogućnost da klonovi postanu patogeni i
neotporni na stres i uslove okoline
– Kloniranje nije uvek uspešno.


Slide 41

Transgene životinje





Unošenje gena (dela DNK) stranog
porekla (druge životinjske vrste ili čoveka) u
genom životinja u cilju trajne promene
genetskog materijala koje će se preneti na
potomstvo
Dobijene su transgene svinje, koze, ovce,
ribe, miševi
Upotreba u naučnim istraživanjima i u
komercijalne svrhre (proizvodnja proteina,
lekova, organa, tkiva za transplantaciju I
veca proizvodnja hrane)


Slide 42

Transgene životinje




1983. R. Brinster ubizgao je je gene
humanog hormona rasta u embrion
miša (super miš).
1984. Naučnici su spojili ćelije embriona
koze i ovce dobili himeru, što je prvi
primer ukrštanja dve razlicite životinjske
vrste.


Slide 43

Transgene životinje
1996. dobijena je transgena koza ``Grace`` sa
genom koji je u stanju da proizvodi BR 96
monoklonalno antitelo koje se koristi u humanoj
medicini
 Ista biotehnološka kuća je napravila transgenu
kozu koja proizvodi anti trombin (lek protiv
zgrušavanja krvi).
 1997. stvoreno je transgeno tele po imenu
`` Rosie`` ono je u stanju da proizvodi mleko sa alfa
laktoalbuminom (humani protein kojim se hrane
prevremeno rodjena deca)
 Postoje i transgene svinje koje proizvode humani
hemoglobin



Slide 44

Postupak dobijanja transgenih
životinja


Slide 45

Dobijanje životinja sa poboljšanim
osobinama za proizvodnju hrane




U Australiji genetičkim inženjeringom su
stvorene nove rase svinja i ovaca koje imaju
za oko 30% veći prirast i za nekoliko nedelja
ranije dospevaju na trzište od tradicionalno
gajenih rasa.
Genetički su izmenjene koke koje kvocaju
(nose 20% manje jaja). Blokiranjem gena koji
proizvodi hormon prolaktin prirodni materinski
instinkt kvocanja je nestao a istovremeno je
nosivost povećana.


Slide 46

Dobijanje životinja sa poboljšanim
osobinama za proizvodnju hrane




Istraživaćki timovi rade na dobijanju lososa
koji ne bi imao samoubilački nagon vec bi
ostajao na otvorenom moru čime bi se
povećala produkcija ove vrste riba.
Većina istraživanja sa ribama usmerena je na
dobijanje klonova u cilju povećanja
proizvodnje (plava revolucija u morskoj
biotehnologiji naspram zelene revolucije u
proizvodnji biljne hrane).


Slide 47

Primena rekombinovane DNK u
farmaceutskoj idustriji








Somatostatin – prvi humani horman,
proizveden u E.c.
Humani hormon rasta – E.c.
Humani insulin - E.c.
Interferon- antivirusna i delimično
atikancerogena supstanca
Relaksin itd.


Slide 48

Vakcine protiv virusa




Postupak proizvodnje vakcina započinje gajenjem
virusa u organizmu neke pogodne životinjske vrste ili
u labaratorijskim uslovima.
Pre nego što se ubrizgaju u organizam čoveka virusi
se usmrte ili oslabe. Imunološki sistem organizma na
prisustvo stranih tela odgovara stvaranjem antitela.
Njihovo stvaranje traje dugo ali oslabljeni ili umrtvljeni
virusi neće naneti štetu organizmu dok imuni sistem
bude bio potpuno spreman da odbije žive snažne
viruse istog tipa pri njihovom kasnijem eventualnom
prodoru u organizam.


Slide 49

Vakcine protiv virusa





Najvece poteškoce su kako i na koji način dobiti
velike količine odredjenog virusa (npr. H1N1).
Virusi su jednostavne gradje (sastoje se iz
genetičkog materijala uvijenog u protein). Imuni
sistem prepoznaje virus samo prema spoljnim
karakteristikama, dakle samo prema proteinskom
omotacu.
Na osnovu ovoga genetičari proizvode vakcine tako
sto u bakteriju uvode gen sa kodom za deo proteina
iz proteinskog omotaca koji izaziva bolest (grip).
Bakterije stvaraju samo virusni protein a ne i cele
viruse.