Istra živanja genoma čoveka

I. Novaković

Nasledna osnova čoveka

•

Podeljena je u 23 para hromozoma

–

+ DNK u mitohondrijama 0.0005% 99.9995%

Organizacija humanog genoma HUMANI GENOM GENOM JEDRA

3000 Mb oko 30.000 gena

kodirajuca DNK

(~10%)

geni i srodne sekvence

(~30%) Jedinstvene ili srednje repetitivne sekvence

nekodirajuca DNK

(~90%)

geni u jednoj ili par kopija

npr.: za hormon rasta, insulin, distrofin

familije gena

pseudogeni fragmenti gena introni, sekvence koje se ne prevode itd.

DNK van gena

(~70%)

MITOHONDRIJALNI GENOM

16,6 Mb 37 gena 13 gena za i RNK 22 gena za tRNK 2 gena za rRNK jedinstvene sekvence ili mali broj kopija (~80%) srednje do visoko repetitivne sekvence (~20%) tandemska ili netandemska ponavljanja rasuti ponovci

clanovi u tandemskom nizu

npr.: za rRNK, tRNK snRNK, histone

clanovi rasuti u genomu

npr.: geni za globinske lance, imunoglobuline, kolagen

Genetički-DNK polimorfizam

 Humani genom: 3x10 9 parova nukleotida svaki 1000. nukleotid je polimorfan  Razlike u nukleotidnom sastavu tj. gradji DNK koje se sreću u populaciji zdravih ljudi  f alela > 1%, hetrozigoti > 2%  Genetički markeri, DNK profil, predispozicija za bolest...

Tipovi DNK polimorfizma

 P olimorfizam pojedinačnih nukleotida (SNP)

AAGGT C ili T GTTC

 Različiti broj uzastopnih ponovaka (VNTR, CNV)

( (CA)25 = ALEL 5 CA)20 = ALEL 4 ( CA)15 = ALEL 3 ( CA)10 = ALEL 2 ( CA)5 = ALEL 1

 Deleciono/insercione varijante

Izvori DNK za analizu



Biološki materijal u kome su ćelije sa jedrom:



krv

      

horionske resice, amnionska tečnost, krv iz pupčanika bris bukalne sluzokože trag telesne tečnosti koren dlake ...

PCR – lančana reakcija polimerizacije molekula DNK

PCR ( umnožavanje odredjenog segmenta DNK pomoću enzima

Taq polimeraze

Real-time PCR

Sekvenciranje DNK

“Genski čip” test hibridizacije na mikroploči

“Genski čip” test hibridizacije na mikroploči

Genetička osnova bolesti

•

Hromozomske aberacije

•

Monogenske bolesti

– – –

AD, AR X vezano preko mtDNK

•

Poligenske bolesti

monogenske forme poligenske/multifaktorske forme

Rodoslovna stabla

muškarac žena nepoznat pol brak aficirana osoba mrtva osoba prenosilac X-vezane recesivne osobine brak u srodstvu dvojaj čani blizanci jednojaj čani blizanci bez potomstva heterozigot za mutaciju koja se prenosi autozomima proband

Mutacije gena

– – –

Delecije = gubitak dela ili celog gena Dupli kacije/insercije = “višak” dela gena

–

Supstitucije (point mutacije) = zamena jednog para baza drugim parom Povećanje broja ponovaka u genu Rezultat: Protein za koji je gen zadužen je IZMENJEN ili ODSUTAN

Segregaciona analiza

• Na koji način se svojstvo-bolest prenosi u porodici?

• Da li način prenošenja odgovara nekom od Mendelskih načina nasleđivanja: •

AR, AD

•

XR, XD

•

Y

Mapiranje gena = određivanje mesta tj. pozicije u genomu

METODE MAPIRANJA GENA

funkcionalno protein RNK DNK poziciono 1,2 2,3 2,4 1,3 1,4 3,4 1,4 Linkage analiza Lod skor > 3

Linkage

analiza analiza vezanosti –

• Zajedničko nasleđivanje dve (ili više) osobina – Osobina + osobina • Osobina + bolest • Bolest + bolest

Odgovorni geni se nalaze na istom hromozomu

Analiza vezanosti = Analiza polimorfnih DNK markera u genomu

• Lod > 3

Lod skor

verovatnoća vezanosti lokusa = 10 3 : 1 = 1.000 : 1 (

• Lod < -2

verovatnoća vezanosti lokusa =

10

-2

: 1 = 0,01 : 1

Fahrov sindrom Idiopatska kalcifikacija bazalnih ganglija

Am. J. Hum. Genet. 65:764–772, 1999

Identification of a Locus on Chromosome 14q for Idiopathic Basal Ganglia Calcification (Fahr Disease)

Daniel H. Geschwind,1,2 Maxim Loginov,1,2 John M. Stern2 1Neurogenetics Program and 2Department of Neurology, UCLA School of Medicine, Los Angeles

III-15a III-18 III-26 IV-7 IV-25 IV-27 IV-32 IV-45 IV-49 IV-51 V-4 V-74b V-75b V-83 V-84 73 76 70 50 52 58 43 46 41 40 38 29 28 10 9 starost početak glavni simptomi 60 70 58 23 37 * 36 37 40 18 * 12 13 6 5 Parkinsonizam, distonija Parkinsonizam disfagija, Parkinsonizam psihoza, Parkinsonizam fokalna distonija, tremor, napadi panike grčevi, jerking ataksija, tremor fokalna distonija, disfagija Parkinsonizam tremor pri pisanju, fokalna distonija, horea fokalna distonija, grčevi fokalna distonija, tremor Tremor, disfagija disfagija, fokalna distonija Tremor, distonija *početak ne (10–20 years, by history).

a Pozitivan CT, poznata klinička slika, ali nije ispitivan (deceased).

b Verovatno aficiran (negativan CT, <30 god.)

Mapiranje gena = određivanje mesta tj. pozicije u genomu

Mapiranje gena = određivanje mesta tj. pozicije u genomu 14q13-21

Gen kandidat….

Genomics 84 (2004) 577–586

Cloning, genomic structure, and expression profiles of TULIP1 (GARNL1), a brain-expressed candidate gene for 14q13-linked neurological phenotypes, and its murine homologue

Thomas Schwarzbraun,a John B. Vincent,b Axel Schumacher,b Daniel H. Geschwind,c Joao Oliveira,c Christian Windpassinger,a Lisa Ofner,a Michael K. Ledinegg,a Peter M. Kroisel,a Klaus Wagner,a and Erwin Peteka,* a Institute of Medical Biology and Human Genetics, Medical University of Graz, Harrachgasse 21/8, A-8010 Graz, Austria bNeurogenetics Section, Centre for Addiction and Mental Health, Clarke Division, 250 College Street, Toronto, ON M5T 1R8, Canada c Department of Neurology and Neurogenetics Program, David Geffen School of Medicine, University of California at Los Angeles, Los Angeles, CA 90095, USA

Ali...

American Journal of Medical Genetics Part B (Neuropsychiatric Genetics) 147B:1319–1322 (2008)

Brief Research Communication

Exclusion of Linkage to Chromosome 14q in aLarge South Tyrolean Family With IdiopathicBasal Ganglia Calcification (IBGC)

Claudia Be´u Volpato,1* Alessandro De Grandi,1 Ebba Buffone,2 Irene Pichler,1 Uwe Gebert,3 Gunther Schifferle,4 Rudolf Scho¨nhuber,2 and Peter P. Pramstaller1,2,5 1Institute of Genetic Medicine, European Academy, Bolzano, Italy 2Department of Neurology, Central Hospital, Bolzano, Italy 3Department of Radiology, Marienklinik, Bolzano, Italy 4Department of Radiology, Central Hospital, Bolzano, Italy 5Department of Neurology, University of Lubeck, Lubeck, Germany

J Mol Neurosci (2009) 39:346–353

2q37 as a Susceptibility Locus for Idiopathic Basal Ganglia Calcification (IBGC) in a Large South Tyrolean Family

Claudia Béu Volpato, Alessandro De Grandi, Ebba Buffone, Maurizio Facheris, Uwe Gebert, Günther Schifferle, Rudolf Schönhuber, Andrew Hicks & Peter P. Pramstaller

Mapiranje gena za ICBG

FS 9 FS9 4 2 2 4 1 1 1 2 3 3 1 1 FS2 2 2 1 3 1 1 3 2 3 3 2 1 FS 2 FS 6 FS6 3 5 3 4 3 5 2 1 1 2 1 1 FS 7 FS7 2 1 2 3 1 4 3 3 2 2 2 1 FS5 2 3 3 3 1 3 2 2 3 1 1 1 FS 5 FS3 2 5 1 4 1 5 3 1 3 2 2 1 D14s596 D14s1014 D14s75 D14s306 D14s288 D14s259 FS1 2 4 1 2 1 2 3 3 3 1 2 1 FS 1 FS 3 FS8 5 2 4 2 5 1 1 1 2 1 1 2 FS 4 FS4 2 4 2 2 1 2 1 3 1 1 2 1 FS 8

Analiza vezanosti u porodici iz Srbije q

= 0.00

D14s596 -3.36

D14s1014 -2.998

D14s75 -3.132

D14s306 -6.573

D14s288 -3.345

D14s259 -5.876

haplotip -5.706

Kostić Vladimir, M. Lukić-Ječmenica, I. Novaković, V. Dobričić, L. Brajković, M. Krajinović, C. Klein, A. Pavlović: Exclusion of linkage to chromosomes 14q, 2q37 and 8p21.1-q11.23 in a Serbian family with idiopathic basal ganglia calcification.

J Neurol. 2011;258(9):1637-42.

Wang C, Li Y, Shi L, Ren J, Patti M, Wang T, de Oliveira JR, Sobrido MJ, Quintáns B, Baquero M, Cui X, Zhang XY, Wang L, Xu H, Wang J, Yao J, Dai X, Liu J, Zhang L, Ma H, Gao Y, Ma X, Feng S, Liu M, Wang QK, Forster IC, Zhang X, Liu JY "Mutations in SLC20A2 link familial idiopathic basal ganglia calcification with phosphate homeostasis". Nat Genet 44 (February 2012).

Sodium-dependent phosphate transporter 2

PIT-2, inorganic phosphate transporter 8p12-p11

Mutations in SLC20A2 are a Major Cause of Familial Idiopathic Basal Ganglia Calcification Neurogenetics, November 2012

F1 Family c.508delT

F5 Family c.583_584delGT

ICBG porodica iz Srbije

• Nema mutacije u SLC20A2 genu!

• GENETIČKA HETEROGENOST!

NATURE METHODS, VOL.5 NO.1, JANUARY 2008

Next-generation sequencing transforms today’s biology

Stephan C Schuster

Poligenske bolesti Genetička osnova

(više parova gena)

fenotip Faktori sredine

Studije asocijacije

Udruženost genskih polimorfizama sa nekom od poligenskih bolesti.

Sklonost tj. podložnost!

Pristupi u izučavanju multifaktorske osnove bolesti

• Studije asocijacije Učestalost polimorfizma: bolesni : zdravi Geni kandidati Čitav genom

Izbor gena-kandidata

– Na osnovu poznavanja etio-patogenetskih činilaca – Geni identifikovani u analizama vezanosti – Geni identifikovani kod animalnih modela

Alzheimer-ova demencija

– ApoE polimorfizam  e 4 alel PREDISPOZICIJA!

– ranije obolevanje ( e 4/ e 4, e 4/ e 3 ) !

– 50-75% heterozig. NE OBOLEVA !

– drugi geni, faktori sredine...

genotip

e

4/

e

4 ,

e

4 /

e

3,

e

4 /

e

2

e

3/

e

3,

e

2/

e

3,

e

2/

e

2

AD 64% Kontr.

31%

36% S A D 69%

AD 47% Kontr.

17%

53% Japan 83%

Studije asocijacije u čitavom genomu ( G enome W ide A ssociation S tudies, GWAS )

Studije asocijacije čitavog genoma (Genome Wide Association Studies, GWAS) • Simultana analiza >10.000 SNP • Microarray tehnologija (genski čip)

GWAS i Alzheimerova bolest

GWAS i Alzheimerova bolest

GWAS i Alzheimerova bolest

GWAS i Alzheimerova bolest

GWAS i Alzheimerova bolest

GWAS i Alzheimerova bolest

• Meta analiza 12 GWAS studija • + 5,043 ispitanika sa Mayo klinike (2,455 AB : 2,588 K) “Investigation of 15 of the top candidate genes for late-onset Alzheimer’s disease” Belbin et al, 2011

GWAS i Alzheimerova bolest

• BIN1, bridging integrator-1 • CLU, clusterin ili complement lysis inhibitor (CLI) • CR1,complement receptor • EXOC3L2, exocyst complex component 3-like 2 • PICALM phosphatidylinositol binding clathrin assembly protein imunomodulacija unutraćelijski transport

GWAS i Alzheimerova bolest

• TNK1, tyrosine kinase, non-receptor, 1 • GAB2, GRB2-associated-binding protein 2 (adapter, aktivator fosfatidil inozitol kinaze 3) • LOC651924 • GWA_14q32.13, PSEUDOGEN, sličan sa Ubiquitin-like 1-activating enzyme E1B • PGBD1, piggyBac transposable element derived 1 • EBF3, early B-cell factor 3 Regulator ćelijskog ciklusa, TSG

“A genome-wide survey of human short term memory” • 909.622 lokusa • Faza 1: Švajcarska (333 ispitanika) – Faza 2: Švajcarska (254 ispitanika) – Faza 3: Nemačka (922 ispitanika) –

Faza 4: Srbija (523 ispitanika)

A Papassotiropoulos etal, 2010

“A genome-wide survey of human short term memory” rs6731900 rs565348

rs10930201

rs2278729 rs11235714 rs225344 Hromozom Gen 2 11 21

SCN1A

(sodium channel, voltage-gated, type I, alpha subunit)

…Funkcionalna NMR

SCN1A (rs10930201) genotip:

AC AA

"A genome-wide survey and functional brain imaging study identify CTNNBL1 as a memory related gene" •

CTNNBL1

= Beta catenin like protein 1 • Hromozom 20 A Papassotiropoulos etal, , 2011.

Problemi kod studija asocijacije • Nekonzistentnost rezultata usled:

– Različite brojnosti ispitivanih populacija – Geografskih/etničkih specifičnosti – Razlika između polova – Sadejstva gen-gen i gen-sredina

“Missing heritability”

B. Maher, Nature, 2008

Moguća objašnjenja

• Rešenje nam je

“pred nosom”

• Odgovorne su retke varijante SNPs , koje GWAS ne analiziraju • Ključne su CNV (copy number variations) a ne SNP • U pitanju je vrlo složena interakcija sredine, kroz generacije...

gena i

Sinteza proteina: transkripcija i translacija

G* DNK RNK AAAAAA obrada translacija

Era OMIKS-a

• Genom – Egzom (sve kodirajuće sekvence) • Transkriptom • Proteom • Metabolom • Interaktom • ….