Transcript Секвениране на ДНК

СЕКВЕНИРАНЕ НА ДНК
Невяна Иванова, доктор
Румяна Додова, магистър
Даниела Дачева, магистър
Център по Молекулна Медицина
Медицински Университет - София
СЕКВЕНИРАНЕ НА ДНК
Oпределяне последователността на свързване на
четирите основни нуклеотидни бази G, А, C, Т, в
първичната структура на ДНК.
 Секвениране генома на РНК-съдържащия бактериофаг MS2
(Fiers et al 1976)
 Секвениране генома на фага Х174 (~5kb) по плюс/минус
метода (Snager & Coulson, 1977)
 Първи метод за секвениране на ДНК: Секвениране чрез
„химично накъсване“, ~500 нтд (Maxam & Gilbert, 1977)
 Секвениране чрез „верижно терминиране на синтеза на
ДНК“, (Sanger et al, 1977)
 Thermal cycle sequencing
 Автоматично секвениране
- Верижно терминиране с флуоресцентно-белязани
дидезоксинуклеотиди (Dye-terminator sequencing);
- Капилярна електрофореза;
- Лазерна детекция на сигнала.
HIGH-THROUGHPUT SEQUENCING












Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS)
Polony sequencing (eмулсионен PCR)
Pyrosequencing
Solexa sequencing (bridge PCR, reversible dye terminator)
Sequencing by ligation (SOLiD)
Ion-semiconductor sequencing
Nanoball sequencing
Single-molecular sequencing (Helioscope)
Single-molecule Real-Time sequencing
Nanopore
VisiGen (FRET, полимераза с флуоресцентен донор в АЦ)
Секвениране чрез хибридизация (Microarray)
Метод на Маxam-Gilbert
 Allan Maxam & Walter Gilbert, 1977г.
 Gilbert, Sanger, Berg, Нобелова награда, 1980, за:
Д“принос към определянето на базовите секвенции в НК” Директно
секвениране, чрез химично модифициране на базите в ДНКмолекулата и последващо базово-специфично накъсване, без да е
необходимо предварително клониране
НЕДОСТАТЪЦИ:
 Изисква голямо количество ДНК
 Токсичност на реактивите
 Невъзможна автоматизация
 Къси секвенции
 Затруднено отчитане
ПРИЛОЖЕНИЕ:
 ДНК-Белтъчни взаимодействия
 Вторична структура на ДНК
 Локализиране на редки бази
 Епигенетични модификации
CH3
Секвениране по Sanger
Frederick Sanger, 1974, Нобелова награда, 1980
Секвениране чрез случайно терминиране на синтеза,
с радиоактивно-белязани ддНТФи
 ДНК, Праймер, Буфер, дНТФ
 ддНТФ
 5´- белязване с 32Р
 Т7 ДНК-полимераза, topt (37°С)
 четири отделни реакции
 всеки етап - в отделен термоблок
THERMAL CYCLE SEQUENCING
( Sears et al., 1992)
Откриване на термостабилна ДНК-полимераза и PCR
 Методът използва dsDNA и много по-малко количество матрица (не е
необходимо предварително клониране на фрагмента).
 Процесът е като PCR, но само с един праймер и всяка реакционна смес
съдържа по един терминиращ ddNTP. За разлика от PCR, нарастването на
продукта е линейно, а не експоненциално, тъй като се копира само едната
верига.
Както при класическия метод на Sanger,
наличието на ddNTP в реакционната смес
води до верижно терминиране.
Получените вериги с различна дължина, се
разделят електрофоретично и могат да се
прочетат.
АВТОМАТИЧНО СЕКВЕНИРАНЕ
(Leroy Hood and colleagues,1986)
Метод за секвениране на ДНК, при който радиоактивно-белязаните
нуклеотиди и директното прочитане, са заменени с флуоресцентно
белязване, лазерно-индуцирана детекция на сигнала и компютъризирано
четене на секвенцията.
Използвани са флуоресцентно-белязани праймери. Приготвят се 4
отделни реакции – по една за всеки ддНТФ, във всяка, от които
праймерът е белязан с различен флуорохром.
Флуоресцентното белязване прави възможно автоматичното прочитане
на секвенцията с помощта на компютърна програма.
Въвеждането на автоматичното секвениране с флуоресцентно-белязани
ддНТФ направи възможно постигането на висока ефективност при
секвениране.
АВТОМАТИЧНО СЕКВЕНИРАНЕ
Секвениране с
флуоресцентно-белязани ддНТФ
Секвениране сфлуоресцентнобелязани праймери
ПРЕДИМСТВА
 без “labeling step”
 Thermal cycle – sequencing
 PCR - апарат
 Надежден, лесноизпълним и ефективен протокол
 Високата температура намалява вторичните структури, висока
специфичност при праймиране, анилинг, удължаване
 Един протокол за секвениране на ss и dsDNA
 Възможност за секвениране на “трудни матрици” (BAC)
АВТОМАТИЧНО СЕКВЕНИРАНЕ С
ФЛУОРЕСЦЕНТНО-БЕЛЯЗАНИ ддНТФи
Смес от
флуоресцентнобелязани ддНТФи
Система за
визуализация
Детектор
Флуоресцентно-белязаните
фрагменти преминават през
детектора по нарастване на
молекулната маса
Р1. Реакциите за четирите ддНТФ се
извършват в една епруветка, като всеки
ддНТФ е белязан с различен флуорофор.
П2. При придвижването си в гела, всеки
фрагмент преминава през детектор, който
идентифицира
терминиращия
ддНТФ,
присъстващ в съответния фрагмент по
сигнала от флуорофора.
И3.
Информацията
от
сигнала
се
преобразува и визуализира като серия от
пикове с различен цвят GATC и позиция.
ВЕРИЖНО ТЕРМИНИРАНЕ С
ФЛУОРЕСЦЕНТНО-БЕЛЯЗАНИ ддНТФи
Rhodamine
Fluorescein
DNA-Rhodamine-Fluorescein
Rhodamine DyeTerminators
АВТОМАТИЧЕН СЕКВЕНАТОР
АВІ3130хl
СИСТЕМЕН ХОД
НА
СЕКВЕНИРАНЕ
ИЗБОР НА СТРАТЕГИЯ
 Дължина на матрицата
 Хомогенност на пробата
 Брой проби
 Информация за региона
СЕКВЕНИРАНЕ De novo
МЕТОДИ
 Shot-gun
 Primer walking
 Случайно праймиране с
транспозони
 Nested - делеции
 Секвениране на мРНК
 PCR-амплификация
RESEQUENCING
 PCR – праймери
 Праймери с “опашка” за секвениране
 Nested (вътрешен) праймери
ЕПИГЕНЕТИКА
След третиране с натриев бисулфит
MLST (Multi Locus Sequence Typing)
Изолиране
на НК
PCR
Пречистване
Секвенционна
реакция
Преутаяване
Капилярна
електрофореза
Анализ на
данните
ОЦЕНКА НА ИЗОЛИРАНАТА ДНК
СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧНО ОПРЕДЕЛЯНЕ
Измерване на УВ-абсорбцията Пурини и
пиримидини – 260 nm
CssDNA = A260 x 33 μg/μl
CdsDNA = A260 x 50 μg/μl
Чистота на ДНК
•А260/A280: 1.7 - 2.0
< 1.7 остатъчни
белтък/фенол
> 2.0 остатъчна РНК
• А230/A260: 0.3 – 0.9
> 0.9 остатъчни захари
АГАРОЗНА ЕЛЕКТРОФОРЕЗА
Mass Ladder
Смес от молекулни маркери
с известна дължина (кб) и
тегло (ng)
ОЦЕНКА НА ИЗОЛИРАНАТА НК
ABSOLUTE QUANTITATION
Измерва общото количество на амплифициращата се ДНК
Изисква изготвяне на стандартна крива с помощта на геномна ДНК с
известна
концентрация,
предварително
измерена
спектрофотометрично
• TaqMan® анализ – изключително точно измерване
• SYBR®Green анализ (MGB) – по-ниско специфичен
Багрилото се свързва с всяка dsDNA
ФЛУОРИМЕТРИЧЕН АНАЛИЗ
Интеркалиращи бои
Hoechst #33258 Нисък афинитет към РНК
свързва се преференциално към АТ-участъци
Етидиев бромид
Свързва РНК, състава на ДНК не е от значение
Детектира много ниски количества ДНК
Висока чистота при ДНК с високо GC-съдържание
PicoGreen
Детектира количества < 25 pg/ml, до 100 ng/ml
ДИЗАЙН НА PCR-ПРАЙМЕРИ
Стандартен PCR
Бисулфит-специфичен PCR
 18 – 24 олигонуклеотид
18-мер за GC-богати участъци
 50°C < Тm < 65°C
Tm = (A+T) x 2°C + (G+C) x 4°C
 Eквимоларно съдържание на нтд
бази: (A+T) / (G+C) - до 60/40
 отсъствие на комплементарни
участъци (праймер-димери)
 отсъствие на вторични структури
(hairpin formation)
 отсъствие на вторично-свързващи
места
 дължина > 30 нуклеотида
 Tm ~ 60°C
 да се избягват СрG в праймера
ТА-богати праймери
формиране на праймер – димери
Концентрация < 3 pmol
mismatch hybridization
↗ Тm
- добавяне на 5´-край за секвениране с универсални праймери
21М13 (Forward)
5´TGTAAAACGACGGCCAGT3´
M13rev (Reverse)
5´CAGGAAACAGCTATGACC3´
Изолиране
на НК
PCR
Пречистване
Секвенционна
реакция
Преутаяване
Капилярна
електрофореза
Анализ на
данните
PCR ЗА СЕКВЕНИРАНЕ
Висока специфичност и чувствителност
Оптимизиран master-mix
“in house” - оптимизация







дизайн на праймери
концентрация на MgCl2
концентрация на dNTP
праймерна концентрация
концентрация на ДНК
параметри на PCR
ензим Taq-полимераза „hotstart“ - метод
PCR - СИСТЕМИ
 Секвенции ~ 600 н.дв., 40 мин. – Бърза амплификация
 Амплификация на тандемно-повторени последователности
 Taq-полимераза с proofreading-активност (< 10 kб)
- за амплификация на микросателитни маркери
 Амплификация на GC-богати участъци
Hot-start – полимераза за ДНК-участъци, съдържащи GC > 65%;
С аксесорни протеини за повишаване на специфичността.
 Секвениране на дълги участъци (long range)
< 15 kб - Hot-start + Proofreading (запазена 3’-5’екзонуклеазна активност),
висока точност при клониране и мутагенеза
< 20 kб Антитяло медииран Hot-start + аксесорни протеини за
повишаване на специфичносттта;
Изолиране
на НК
PCR
Пречистване
Секвенционна
реакция
Преутаяване
Капилярна
електрофореза
Анализ на
данните
КОЛИЧЕСТВО И КАЧЕСТВО НА
ДНК-МАТРИЦАТА ЗА СЕКВЕНИРАНЕ
n (брой бази в таргетната секвенция)
50
=
Количество ДНК матрица (ng)
 Наличие на протеини, детергенти, геномна ДНК
Намаляват живота на капилярата
Късен старт на секвенцията
 Непречистена матрица или наличие на множество матрици
Дължината на четене намалява
Намаляват живота на капилярата
Лошо качество на данните
 Наличие на соли и ЕДТА-съдържащи буфери
Инжектират се преференциално
Инхибират ДНК-полимеразната активност
Лошо качество на данните
ПРЕЧИСТВАНЕ НА PCR-ПРОДУКТА
Премахване на остатъка от реакционните компоненти
Праймери
Мултиплено секвениране
дНТФ
Оптималното дНТФ/ддНТФ
Соли
Инхибира секвеназата
Неспецифични PCR-продукти
Артефакти в секвенцията
МЕТОДИ ЗА ПРЕЧИСТВАНЕ
Ензимен
Разреждане
Eкзонуклеаза I (ЕхоI)
PCR-продукт/
- разгражда едноверижна дест. вода
ДНК (праймери)
(1/5 или 1/10)
Алкална фосфатаза
(SAP/CIP) -дефосфорилира
дНТФ
Колонен
- гел-филтрация
- ултрафилтрация
Гел-екстракция
ИЗБОР НА МЕТОД ЗА ПРЕЧИСТВАНЕ
Зависи от качеството на PCR-продукта
Метод
Ензимен
Разреждане
Ограничения
Предимства
При наличие само на Бърз и евтин
1 специфичен PCRВисок добив
продукт
Възможност за
автоматизация
Висока ефективност
1 PCR-продукт
при използване на
PCR с праймери
микроплаки
≤0.2μm
и дНТФ ≤ 100 μm
Недостатъци
Не премахва
неспецифичните PCRпродукти и праймердимерите
Изисква оптимизация
Не премахва
неспецифичните PCRпродукти и праймердимерите
Ултрафилтрация
Странични продукти
<100н.дв.
(праймер-димери)
Бърз и евтин
Възпроизводим
Най-ефективен за
премахване на соли
Относително скъп
Не премахва
неспецифичните PCRпрод. >100н.дв.
Гелекстракция
Не зависи от
качеството на
PCR-продукта
Отстранява
неспецифичните PCRпродукти и праймердимерите
С променлив резултат
Нисък добив
Изисква време
УВ (накъсва ДНК)
ИЗБОР НА СЕКВЕНЦИОННИ ПРАЙМЕРИ
PCR-праймери като секвенционни праймери
• различен секвенционен микс за всеки праймер (F/R) в един
ампликон и за всеки различен ампликон
PCR-праймери с “опашка” за секвениране (Sequencing Tail)
•
•
•
•
универсални праймери - M13, T7, SP6
еднакъв секвенционен микс за различните реакции
Увеличено количество продукт
Възможност за секвениране на по-дълги участъци (500-900 н.дв.
BAC, PAC) при използване на по-дълги праймерни
последователности (24 н.дв.)
• необходимост от висококачествени олигонуклеотиди
вътрешни (nested) секвенционни праймери
• Primer walking
• генотипиране
Изолиране
на НК
PCR
Пречистване
Секвенционна
реакция
Преутаяване
Капилярна
електрофореза
Анализ на
данните
THERMAL CYCLE SEQUENCING
ДНК-матрица
Праймер
BigDye®Terminator
Буфер
AmpliTaq®DNA Pol FS
- ниска дискриминация между дНТФ и ддНТФ;
- почти липсваща 5´-3´-eкзонуклеазна активност;
- комбиниран с термостабилна неорганична пирофосфатаза.
BigDye®Terminator Sequence Kits
Секвенционен кит
BigDye®Terminator
v3.1
Описание
Сравнително, de novo, ре- секвениране;
Секвениране на дълги матрици, динтд повтори
Съдържа dITP вместо dGTP за намаляване компресията
на пиковете
BigDye®Terminator
v1.1
Оптимално прочитане в близост до праймера
Секвениране на къси PCR-продукти
Секвениране на дълги матрици и динтд повтори
Съдържа dITP вместо dGTP
dGTP
BigDye®Terminator
Съдържа dGTP;
Секвениране на G-богати мотиви
dRhodamine®
Terminator
Секвениране на хомополимерни участъци и Т-мотиви
Съдържа dITP вместо dGTP
BigDye® Primer
Секвениране на ssDNA и dsDNS и PCR-матрици
Генерира пикове с еднаква височина
Оптимално четене в близост до праймера
Секвениране на GT-богат район с BigDye®Terminator v3.1/1.1
Секвениране на GT-богат район с dGTPBigDye®Terminator v1.0/3.0
Секвениране на 2 хомополимерни Т-участъка с dRhodamine®Terminator
Изолиране
на НК
PCR
Пречистване
Секвенционна
реакция
Преутаяване
Капилярна
електрофореза
Анализ на
данните
ПРЕЧИСТВАНЕ НА СЕКВЕНЦИОННИЯ ПРОДУКТ
Остатъчните небелязани и флуоресцентно – белязани компоненти на
реакцията възпрепятстват електрокинетичното инжектиране на
пробата, електрофоретичното разделяне и анализа на данни.
„dye blobs“
МЕТОДИ ЗА ПРЕЧИСТВАНЕ НА СЕКВЕНЦИОННИЯ ПРОДУКТ
Мембранно филтриране
Гел-филтрация
BigDye®XTerminator
Магнитни частици
Етанолна преципитация
EDTA/CH3OONa/ЕТАНОЛНА ПРЕЦИПИТАЦИЯ
Преутаяване на секвенционния продукт с абсолютен етанол
•EDTA – стабилизира секвенционния
•Натриев ацетат – запазва късите секвенционни продукти
Лесен и евтин
Възпроизводим
Работа с всички формати
Относително дълга процедура
Центрофуга с носачи за плаки
Риск от загуба на утайката
Провежда се при стайна температура
Абсолютен етанол – 96%
Използва се прясно приготвен етанол
3 М Натриев ацетат (pH 4.8)
Отстраняване на етанолните остатъци след
последното центрофугиране
ГЕЛ-ФИЛТРАЦИЯ
Колона Sephadex G-50
• пореста смола „молекулно сито“
• секвенционната реакция се нанася в
центъра на колоната
• „задържа“ LMW-молекули и пропуска
HMW-молекули
Лесен
Възпроизводим
Подлежи на автоматизация
Смес от LMW и
HMW - молекули
Филтрираща смола
LMW се абсорбират
и елуират последни
HMW преминават
свободно и се
елуират първи
Относително скъп
Допълнителна обработка с
SDS и нагряване (BDТv3.1)
УЛТРАФИЛТРАЦИЯ
Отстраняване на замърсяванията чрез филтриране на
секвенционния продукт през финна мембрана с размер на
порите 0.1 – 10 μm
ПРЕЧИСТВАНЕ С МАГНИТНИ ЧАСТИЦИ
Афинитетна хроматография с магнитно разделяне
• магнитни частици, с имобилизиран лиганд (целулоза, оligo (dT),
стрептавидин и др.), с афинитет към НК
• лигандът свързва секвенционният продукт, а дНТФи, праймери и
соли остават в разтвора
Ресуспендирани
магнитни частици
Добавяне на смес с
таргетната молекула
2. Елуиране на таргета с нискосолеви буфери или дестилирана
вода
Лиганд
Свързване на лиганда с
магнитните частици
Лесен и ефективен
Високо специфичен
Възможност за роботизация
Магнитно разделяне и
отстраняване на надутайката
1. Отмиване
Афинитетно
свързване
3. Отстраняване на магнитните
частици в магнитно поле
Относително скъп
Изисква биотинилиран праймер
Изисква специална апаратура
Изолиране
на НК
PCR
Пречистване
Секвенционна
реакция
Преутаяване
Капилярна
електрофореза
Анализ на
данните
ПОДГОТОВКА НА ПРОБАТА ЗА ИНЖЕКТИРАНЕ
ПРЕЧИСТЕН СЕКВЕНЦИОНЕН ПРОДУКТ
BigDye®XTerminator™
УТАЙКА
ЕЛУАТ/ФИЛТРАТ
Ресуспендиране в
HI-DI™ формамид
ЕЛЕКТРОКИНЕТИЧНА ИНЖЕКЦИЯ
Не е необходима топлинна денатурация преди
инжектирането
ПОДГОТОВКА НА ИНСТРУМЕНТА
КОНСУМАТИВИ ABI3730xl
Секвенционни стандарти
Полимер РОР™
Капиляри
Буфер за електрофореза
КАЛИБРАЦИЯ НА ИНСТРУМЕНТА
Пространствена
Спектрална
Data Collection software
СЪЗДАВАНЕ НА ФАЙЛ С ВХОДЯЩИТЕ ПРОБИ
ДЕФИНИРАНЕ НА ГРУПИ С РЕЗУЛТАТИ
ИЗБОР НА ПРОТОКОЛ
Instrument protocol
Analysis protocol
ПОСТАВЯНЕ НА ПРОБИТЕ В АПАРАТА
СТАРТИРАНЕ НА ИНСТРУМЕНТА
Изолиране
на НК
PCR
Пречистване
Секвенционна
реакция
Преутаяване
Капилярна
електрофореза
АНАЛИЗ НА ДАННИТЕ
Анализ на
данните