Transcript Полимеразна верижна реакция в реално време (RT-PCR)

ЦЕНТЪР ПО МОЛЕКУЛНА МЕДИЦИНА
Медицински Университет - София
СБАЛАГ "МАйЧИН ДОМ"
Теоретичен и практически курс на тема:
„Съвременни молекулярно- генетични методи”
High resolution melting analysis
– високо ефективен и бърз метод за генотипиране на
единични нуклеотидни замени и ДНК – метилиране в къси
ампликони
Рени Цвеова
Стоян Бичев
Stefano Pierini
1953
1983
2013
http://www.nature.com/nature/dna50/watsoncrick.pdf
Полимеразна верижна реакция (PCR) – основни принципи
95°C
30s
50- 70 °C 30s
72 °C 30s
Полимеразна верижна реакция
• разграничаване на PCR
продуктите само по техния
размер
• ниска резолюция
• двустъпална процедура
• Използване на Ethidium
Bromide или други подобни бои.
Полимеразна верижна реакция в реално време (RT-PCR)
• Отчитане на амплификацията на всеки цикъл от PCR-a
• Няма нужда от тестване на PCR- a на агарозни или други гелове.
• Възможност за извършване на различни анализи
Видове полимеразна верижна реакция в реално време
(RT-PCR)
Полимеразна верижна реакция в реално времеосновни принципи
•Метода е основан на количествено отчитането на флуоресцентен сигнал.
• Момента, в който имаме значително усилване на флуоресцентния сигнал се
отбелязва с (CT - threshold cycle).
Основни етапи на HRM анализа
Всичко, което Ви е необходимо е PCR апарат спосбен да измерва много малки
нива на промяна на флуоресценция.
1. PCR в реално време
Позволява ни да наблюдаваме промяната на флуоресценцията
при всеки цикъл в реално време
2. HRM
Отчитане на спада на флуресцентния сигнал в резултат на топенето
на PCR продуктите, като различните по секвенция ампликони се
топят при различна температура.
Етап 1.- PCR
Наблюдаване процеса на амплификация в реално време.
Плато
Линейна фаза
Стойността CT се определя от цикъла в който PCR апарат отчита
значителна промяна на флуоресценцията.
Стойността CT е обратно пропорционална с кооличеството на ДНК.
Изходното количество ДНК обикновенно е 25ng. So why different CTs ???
Качество на
ДНК
Нива на експресия
Изходно количество на таргета
Видове флуоресцентни багрила
Използваните бои са силно флуоресцентни когато са свързани с двуверижни ДНК
вериги и слаби когато не са.
Насищащи бои
Могат да се използват в големи
SYTO9, LC Green and EvaGreen… концентрации, които да осигуряват
пълно насищане на ампликона.
Не инхибират ДНК полимеразата
Не променят температурата на
хибридизация на праймерите.
Няма преразпределение на боята по
време на топенето на веригите, поради
постигнато пълно насищане.
Тъй като имаме пълно насищане на PCR продуктите с флуоресцентни багрила, се
наблюдава много прецизно съотношение между количеството PCR продукт и
силата на флуоресцентния сигнал
Етап 2.- HRM
В началото на анализа имамеме много високи
нива на флуоресценция на всяка проба, поради
милионите ампликони.
С повишаване на
температурата настъпва
разделяне на двете
вериги на ДНК, в
резултат на което спада и
флуоресцентният сигнал.
Етап 2.- HRM
Spot the difference !
Профилът на топене
зависи главно от:
Homo
- секвенцията на ампликона
- GC съдържанието.
Hetero
WT
Приложения на HRM
Генотипиране: SNP
Скрининг за мутации:
генотипиране и разграничаване
на познати алели.
идентификация на неизвестни
секвенционни варианти
ДРУГИ...
Епигенетика: оценяване
нивата на промоторно
хиперметилиране при различни
гени.
Скрининг на хетерозиготни
проби: устанивяване на
хетеродуплекси в резултат на
mispairing.
Конкурентни методи на HRM
Секвениране
• SNP генотипиране
• мутационенн скрининг
• .....
PCR в реално време базиран на
Taq-Man технологията
• SNP генотипиране
• Епигенетични анализи
• .....
Mass spectrometry
• Епигенетични анализи
• .....
Конкурентни методи на HRM
Метил специфичен PCR – MSP
•Епигенетични анализи
ДНК чипове
•Епигенетични анализи
• .....
Рестрикционни анализи
• Епигенетични анализи
• SNP генотипиране
• .....
Предимства на HRM пред другите методи
• сравнително по- евтин спрямо методи като секвениране и TaqMan
генотипиране.
• идеален за големи проекти за SNP генотипиране.
• бърз и надежден.
• лесенo изпълним.
Неодостатъци на HRM пред другите методи
• Труден за оптимизация
• не е толкова специфичен колкото TaqMan технологията
• необходимост от високо- квалифициран специалист.
• необходима е прецизна оптимизация на PCR условията.
Rotor Gene 6000 by QIAGEN
•PCR апарат с ротор: Иновативна
технология с въртящ се ротор със скорост
400 rpm.
Rotor Gene 6000 by QIAGEN
Reaction Chamber
Detection
Filters
Lens
PMT
Detector
Assembly
LED Light
Source
Assembly
Tubes Spin in
Rotor (Red)
Spindle/Motor
Assembly
Предимства на роторния формат
– Не е необходима оптична нормализация
– Не се използва парафин или нагряващ капак
– Не остават мехурчета, които да пречат на отчитането на сигнала
– Няма нужда от референтна боя
– Оптичният източник е LED
От… - До…
Дизайн
PCR
1. Селектиране на
таргетната секвенция
4. Приготвяне на PCR
реакцията
2. Дизайн на праймери
5. Програмиране на PCR
апарата
3. Проверка на праймерите
6. Тест на PCR продукта *
Анализ
Дизайн
За постигането на максимална специфичност най- подходчщи са ампликони с
големина до 200 б.дв.
Дизайнирането на праймери отговарящи на тези критерии може да е трудна
задача, тъй като късите ампликони подходящи за HRM ограничават избора на
праймери.
Една от най- често използваните програми за дизайн на праймери е
Primer 3
На какво да обърнем внимание?
• Позиция на праймерите
• GC съдържанието на праймерите в 3’ края им (GC clamp)
• При метил-специфичен HRM (MS- HRM) e удачно използването на GC free primers
• Специфичност на праймерите
• Наличие на вторични структури (primer dimer)
PCR
Step
Components
Final Concentration
Enzyme
activation
Duration
Temp.
3 min
95°C
Denaturation
10 -20 sec
95 °C
1X
Annealing
15 - 30 sec
_ °C
MgCl2
1.5 mM – 4.0 mM
Extention
15 - 30 sec
72 °C
dNTPs
100 µM – 200 µM
HRM
0,1°C/sec
increment
65-90
°C
Forward Primer
150 nM – 300 nM
Reverse Primer
150 nM – 300 nM
Syto9
1.0 µM – 1.5 µM
Tot Volume
10X PCR Buffer
25 µl
Taq Polymerase
0.75 U – 1.5 U
DNA
20 ng – 40 ng
Cycles
30 -50
Анализ!!!