Transcript Фосфолипаза C

Йордан Стефанов
Продукция и пречистване на
фосфолипаза C
от щамове Bacillus cereus и Bacillus thuringiensis
H3PO4
↑ температура
H20
1600
Конвенционалните методи за рафиниране на растителни масла
изхвърлят 12 000 тона CO2 в атмосферата годишна. Това са
въглеродните емисии на 1600 човека за една година. Използването
на Фосфолипаза C спестява тези емисии!
60% до 73%
15% до 26%
Фосфатидил сфингозин,
фосфатидил холин фосфатидил етаноламин фосфатидил инозитол
30% фосфолипиди
32% липиди
16% протеини
50% вода
Групи фосфолипази
PLA1
Фосфолипази
Фосфолипаза А
PLA2
Фосфолипаза B
SMase
Фосфолипаза C
PI-PLC
Lecithinase
PLD1
Фосфолипаза D
PLD2
Места по фосфолипидната молекула,
върху които действат различните групи
фосфолипази.
Източник: American society for
microbiology
Морфология на клетки Bacillus thuringiensis:
(А) - средна вегетативна фаза.
(1) - спори
(B) - ранна спорулационна фаза
(2) – кристали
(C) - късна спорулационна фаза
Bacillus cereus
Източник: University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences Brno
Цел на настоящата дипломна работа е проучване на
фосфолипазната продукция и пречистване на
фосфолипаза С от щамове Bacillus cereus и Bacillus
thuringiensis.
За изпълнението на целта са поставени следните задачи:
1) Изследване на щамове Bacillus cereus и Bacillus thuringiensis
за продукция на фосфолипаза C.
2) Определяне на подходящи културални условия за синтез на
ензима.
3) Определяне на динамиката на ензимната секреция.
4) Пречистване на фосфолипаза С от щам-продуцентите Bacillus cereus и Bacillus thuringiensis.
Фосфолипазна С активност на щамове Bacillus
cereus и Bacillus thuringiensis. Един „+“
съответства на диглицеридна зона с r=1 mm.
Щам
PLC активност 24h
PLC активност 48h
B. cereus 32
+++
++++
B. cereus 55Y
+++
+++++++
B. cereus 68
+++
++++++
B. cereus 72 СТЗ
++++
+++++
B. cereus 6
++++
+++++
B. thur. 1413
+++
+++++
B. thur. 4
++++
+++++
B. thur. var th 17
++++
+++++
B. thur. var 17
+++
++++++
B. thur. Kenyae SD
+++
++++
Bacillus cereus
12
10
5
4
8
3
6
2
4
2
1
0
0
LB 1
Tryptic
broth
Gerasimine
Taguchi
Кл. Плътност
Активност (U/ml)
Клетъчна плърност (MF-units)
Фосфолипазна активност на щамове Bacillus cereus и
Bacillus thuringiensis на различни хранителни среди
LB 2
Активност
Bacillus thuringiensis
4.5
4
10
3.5
8
3
2.5
6
2
4
1.5
1
2
0.5
0
0
LB 1
Tryptic broth Gerasimine
Taguchi
Кл. Плътност
LB 2
Активност
Активност (U/ml)
Клетъчна плътност (MF-units)
12
Фосфолипазна активност на щамове Bacillus cereus и
Bacillus thuringiensis при различна продължителност на
култивиране
4.5
4
Активност (U/ml)
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
B.c. 55Y
B.c. 68
B.c. 72 СТЗ B. thur. var th B. thur. 4
17
8 часа култиване
12 часа култивиране
B. thur. var
17
Фосфолипазна С активност на щамове B. cereus и
B. thuringiensis след субкултивиране
6
Активност (U/ml)
5
4
3
2
1
0
6 часа
8 часа
Bacillus cereus 55Y
10 часа
Bacillus thuringiensis var th 17
Динамика на продукцията на фосфолипаза C от B.
cereus 55Y и B. thuringiensis var thuringiensis 17
6
Активност (U/ml)
5
4
3
2
1
0
2h
4h
6h
8h
10h
B. cereus 55Y
12h
14h
16h
18h
B. thuringiensis var th 17
20h
22h
24h
Промени в pH на културалната среда на щамове
B.thuringiensis var. thuringiensis 17 и Bacillus cereus
55Y.
10.000
9.500
9.000
pH
8.500
8.000
7.500
7.000
6.500
6.000
0h
2h
4h
6h
8h
B. cereus 55Y
10h
12h
14h
16h
18h
B. thuringiensis var th 17
20h
22h
24h
Бактериален растеж при щамове B.
cereus и B.thuringiensis
10.000
Клетъчна плътност (MF-units)
9.000
8.000
7.000
6.000
5.000
4.000
3.000
2.000
1.000
2h
4h
6h
8h
10h
12h
B. thuringensis var. th 17
14h
16h
18h
B. cereus 55Y
20h
22h
24h
Пречистване на фосфолипаза С от Bacillus cereus 55Y и
B. thur. var thur. 17 след утаяване с изопропанол
Bacillus
Cereus
55Y
Активност
(U)
Общ
белтък
(mg)
Спец.
активност
(U/mg)
Пречистване
(пъти)
Добив
Супернатанта
32.76
483
0.07
0
100 %
Преципитат
2.12
14
0.15
2.23
6.47 %
Bacillus
thuringiensis
var. th 17
Активност
(U)
Общ
белтък
(mg)
Спец.
активност
(U/mg)
Пречистване
(пъти)
Добив
Супернатанта
24.24
253.2
0.10
0
100 %
Преципитат
2.204
2.4
0.92
9.59
9.09 %
Пречистване на фосфолипаза С на B.cereus 55Y
чрез изсолване с амониев сулфат
Bacillus
cereus 55Y
Общ
белтък
(mg)
Спец. активност
(U/mg)
Пречистване
(пъти)
Добив
Супернатанта
152.25
0.12
0
100 %
(NH4)2SO4преципитат
5.78
1.34
11.17
43.89 %
Ултрафилтрация
Bacillus
thuringiensis
var. th 17
Активност
(U)
Общ
белтък
(mg)
Спец.
Пречистване
активност
(пъти)
(U/mg)
Супернатанта
77.24
256.8
0.32
0
100 %
Ултрафилтрат
17.17
51.1
0.37
1.16
24 %
Bacillus cereus
55Y
Активност
(U)
Общ
белтък
(mg)
Супернатанта
51.24
362.6
0.144
0
100 %
Ултрафилтрат
15.20
73.6
0.209
1.593
30.71 %
Спец.
Пречистване
активност
(пъти)
(U/mg)
Добив
Добив
Културалните супернатанти на щамовете продуценти са
подложени на ултрафилтрация през мембранни филтри
DDS Type GR 61 pp. size 20 000 (Denmark).
Гел-филтрация на ултрафилтрат от
Bacillus thuringiensis var. th 17
3
0.35
0.3
2.5
0.25
2
0.2
1.5
0.15
1
0.1
0.5
0.05
0
A595 (nm)
Активност (U/ml) / Hartree (mg/ml)
B. thuringiensis var. th 17
Гел филтрация на
препарат от B.
thuringiensis var. th 17
след ултрафилтрация.
0
1
10
Активност (U/ml)
Пречистване на
фосфолипаза C от B.
thuringiensis var. th 17.
20
30
40
Протеин по Hartree (mg/ml)
А595 (nm)
Активност
(U)
Общ
белтък
(mg)
Спец.
активност
(U/mg)
Пречистване
(пъти)
Добив
Супернатанта
77.24
256.8
0.32
0
100 %
Ултрафилтрат
17.17
51.1
0.37
1.16
24 %
Sephadex G75
12.39
10.12
1.15
3.73
18.2 %
Гел филтрация на ултрафилтрат от
Bacillus cereus 55Y
3
0.8
0.7
2.5
0.6
2
0.5
1.5
0.4
0.3
1
0.2
0.5
A595 (nm)
Активност (U/ml) / Hartree (mg/ml)
Bacillus cereus 55Y
Гел филтрация на
препарат от Bacillus
cereus 55Y след
ултрафилтрация.
0.1
0
0
1
10
Активност (U/ml)
Пречистване на
фосфолипаза от
Bacillus cereus 55Y.
20
30
40
Протеин по Hartree (mg/ml)
A595 (nm)
Активност
(U)
Общ
белтък
(mg)
Спец.
активност
(U/mg)
Пречистване
(пъти)
Добив
Супернатанта
51.24
362.6
0.14
0
100 %
Ултрафилтрат
15.20
73.6
0.21
1.593
30.71 %
Sephadex G75
14.94
10.71
1.51
11.73
29.58 %
P. pastoris SMD1168
Първа стъпка: отделяне на клетките от културалната
течност чрез центрофугиране.
Втора стъпка: избистряне културалната течност чрез
специални clarification филтри.
Трета стъпка: йонообменна сорбция.
Четвърта стъпка: концентриране на супернатантата
чрез ултрафилтрация.
Пета стъпка: топлинно третиране на ултрафилтрата.
Шеста стъпка: диафилтрация.
Благодаря за вниманието!