Transcript Нанохирургия - Медицински Университет





Клетки
Микроскоп
Светлина
Атоми
•
•
•
•
Клетъчна структура
Електромагничтна радиация
Атомни модели
Транспорт на флуиди
• Калций медиирани сигнали
• Клетъчни микроинжекции
• Карбонови нанотръбички
• Карбонови нанопипети
• IP3, NAADP, cADPr
Нанохирургия – използване
на
наносонди
за
въвеждане на вещества в
една клетка и изследване
на отговора ѝ.
Courtesy of DOE: www.nano.gov/html/facts/The_scale_of_things.html
Клетките са градивните елементи на живота
 Най-малката жива единица, която извършва
функции характерни за живота

 Метаболизъм
 Транспорт на вещества
 Възпроизвеждане/ растеж - митоза
Всички живи същества са изградени от клетки
10-100 трилиона клетки в тялото на възрастен човек
Повече от 20000 различни клетки с различни
функции
За да се наблюдават е необходим микроскоп, а да за
се манипулира с клетки са неоходими инструменти
от наноскалата
Много различни типове клетки в
човешкото тяло
За да се разбере как функционират
клетките е необходимо да се знае как
организма функционира
“Клетъчната нанохирургия” е начин да се
изследват отделни клетъчни среди и
механизма на възстановяване / замяна
/ промяна на вътреклетъчни органели.
Стволова клетка “Бяла” и червени
кръвни клетки
Неврон
Костни клетки
Много от болестите
могат да бъдат
излекувани единствено
на клетъчно ниво

Наномедицина – повлияване на субклетъчно ниво
– органели и процеси
Например: Генна терапия – една обучена клетка
може да контролира хиляди антиракови клетки
Конвенционалната хирургия е физикална интервенция да открие
процеса и/или проблема и да се премахне, замени или
модифицира част от тялото.
Разрез
Въвеждане на
медикаменти
Хирургия в
макроскопската
сфера
Манипулации
Мониториране
Откриване проблема и да се премахване, замяна или
модифициране компоненти.
3m
Клетки
100 μm
60μm
Ядро, Органели
10 μm
1 μm
Белтъци, Клетъчен склет, ДНК
100 nm
10 nm
1 nm
Хирургия може да бъде извършена върху клетки чрез
инструменти от наноскалата.
Разрязване
Въвеждане на
вещества
Клетъчна
нанохирургия
Манипулиране
Мониториране
1) Оптични микроскопи
 Инструменти проектирани да създават
посредством магнитни вълни образ.
 Показва детайли видими за човешкото
око или камера.
2) Флуоросцентни микроскопи
 Използване на светлина визуализираща
флуоресциращи молекули за
отдиференциране от нефлуоресциращи
материали.
Визуализиране на
клетъчни органели
Визуализиране на
клетъчни процеси
Инвертиран

Разнообразни техники
Вирусни
Невирусни
Химична ендоцитоза
Фагоцитоза на частици
Инжектиране на флуиди

Въвеждане на флуиди
През наноканали
Минимално инвазивно за
клетки
Минимално увреждане на
клетките
1) Трайно изменяне или промяна
на клетъчното поведение –
диференциация на стволови
клетки.
Например: Модифициране на
клетка да продуцира и
експресира зелен
флуоресциращ белтък (GFP)
Идеята на това е да накараме
клетката да произвежда
определени субстанции
Въвеждане
DNA-GFP
Plasmid
Ядрото
произвежда RNAGFP
Клетката
произвежда
GFP
2) Изследване на клетъчни
отговор на стимули
Например: Определяне дали
клетката освобождават
калции при среща с
определена молекула
Идеята да оценим отговора на
клетката след стимул
Въвеждане на
молекула
Молекулата
въздейства върху
органели
?
?
Органелите
освобождават
Са2+
Клетки от орален
карцином (~15 um
диаметър) инжектирани
с флуоресциращи
протеини
Протеините не могат да бъдат
различени с светлина от
видимия спектър, за това се
използва флуоресценция
Инвертиран микроскоп
Манипулатор
(Eppendorf)
Perfusion System
Филтър
(Sutter)
Инжекционна
система
(Eppendorf)
CCD камера (Roper)
Ex
Em
Клетки от рак на
гърдата
(SKBR3)
инжектирани с
Fura-2AM
Ex: 340, 380 nm
Em: 540 nm
Флуоросцентни
снимки(340/380)
Базови
Освобождаващи
IP3 – inositol triphosphate
Таргетна клетка
Преди инжектиране След инжектиране
IP3
Ly
ER
Ca2+
Traces = average 6 cells +/- s.e.m
cADPr - cyclic adenosine diphosphate ribose
• Калций освобождаван от cADPr
когато киселите калциеви складове
са изчерпани.
• Не се освобождава калций когато Ry
рецептор е блокиран.
• Заключение  ER е чувствителен на
cADPr през Ry рецептор.
cADPr
Ly
ER
Ca2+
Traces = average 6 cells +/- s.e.m
= Мембранни органели
Функции:
• Мобилност на
клетката и
здравина
• Транспорт
Състои се от:
• Микротубули (в
жълто, 25nm)
• Микрофиламенти
(синьо, 8nm)
• Интермедиентни
филаменти (10nm)
Склад на генетичната
информация (ДНК)
Транспортира вещества
през пори
Епителна клетка
Функция:
• Протеинов синтез,
компресиране и
транспорт
• Калциева сигнализация
Комплакс от лабиринти от
тубули
Рибозоми – протеинов
синтез
Апарат на Golgi – пакетира
и транспортира
вещества от ER до
специфични части на
клетката.
Участва в създаването
на Лизозомите
Лизозоми – Вътреклетъчно
смилане, калциева
сигнализация.
Вътреклетъчния Ca+2 регулира процесите чрез активиране или
инхибиране сигнално канали или протеини
Дългосрочни
• Генна експресия
• Клетъчен цикъл
• Растеж
• Делене
• Апоптоза
Краткосрочен
• Секреция
• Съкращение
• Предаване на
сигнал в синапси
• Метаболизъм
Вторичниете сигнални молекули пренасят сигнали през
мембраната за освобождаване на складирания вътреклетъчен
калции.
Нерегулираното
освобождаване на калций
се асоциира с карцином
Някои вторични сигнални молекули:
• IP3 – Inositol triphosphate
• cADPr – Cyclic adenosine diphosphate ribose
• NAADP – Nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate
Складове за калций:
• Ендоплазмен ретикулум (ER) – чувствителен към IP3 and cADPr
• Лизозоми (Ly) – чувствителни на NAADP**
Клетките са пертъпкани среди
приютяващи разнообразни
органели и скелетни
структури разпределени във
воден разтвор съдържащ соли
и органични материи.




Вътреклетъчната среда е различна от
извънклетъчната
Клетките са издръжливи, но и много
крехки – чувствителни на увреда на
мембранатаи промени на йония баланс
Чужди тела могат да отключат
възпалителен процес
Клетките са пренаселени пространства –
органелите лесно могат да се увредят
или разрушат
Intracellular
Extracellular
150mM K+
4mM K+
20mM Na+
145mM Na+
4mM Cl-
110mM Cl-
0.1μM Ca++
2mM Ca++
Цели при въвеждане на вещества в клетка
• Да не сеубие клетката в началото
• Да не се увреди клетката, така че да не може да се възстанови
• Да не се променя неблагоприятно клетката  нежелано
повишаване на вътреклетъчния калций
• Контролирано доставяне на вещества на клетката
• Безопастно и ефикасно


Вирусна трансфекция
Невирусна трансфекция:
Липозоми
Фагоцитоза на наночасти
Електропорация
Фототрансфекция (лазерна аблация)
Въвеждане на наночастици в клетка чрез
сонда
Инжектиране на разтвори
Използване на вируси за модифиране на клетки чрез
въвеждане на ДНК
1)
Introduce virus
4)
2)
3)
Plate of cells
Cells
Virus
Infected cells
Това е публикация нашумяла в медийте за пациент починал
след лечение с вирусна трансфекция поради труден контрол на
страничните ефекти
Физическа транфекция – въвеждане на молекула, медикамент, протеин и др.
директно в клетката чрез физичен метод.
Видове невирусна трансфекция
• Вещества във везикул
• Вещества прикрепени към повърхност
• Вещества въвеждани директно чрез сонда
Предимства
• Елиминира опасенията за безопасност
• Разнообразие от техники от които може да избирате при
конкретните условия
• Може да се използва за големи групи от клетки или отделни клетки
Недостатъци
• По-малко ефективна от вирусна трансфекция
• Нужда от специална апаратура
Липозоми
• Опаковано вещество в
двуслойна липозома
• Капсулата прави контакт
с клетъчнаа мембран
• Освобождаване на
съдържимото
Заредените кополимери
• ДНК свързана с полимерна
частица
• Частица свързана с клетката
• Клетка носеща частица
(ендоцитоза)
• Клетъчна популация, Технически невзискателна трансфекция
• Невъзможност за контрол на концентрацията и мястото на
въвеждане
Фагоцитоза
• Твърди материали влизат в
контакт с клетка (гравитация,
центруфугиране, магнит)
Клетката приема материалите
Магнетизъм
• Клетъчна полулация, Технически невзискателна трансфекция
• Невъзможност за контрол на концентрацията и мястото на
въвеждане, Частици остават в клетката
“Изстрелване”
Магнитно придвижване
Видими
дефекти на
клетъчната
мембрана
Видими
дефекти на
клетъчната
мембрана
• Клетъчна полулация, Технически невзискателна трансфекция
• Невъзможност за контрол на концентрацията и мястото на
въвеждане, Частици остават в клетката
Въвеждане чрез
изстрелване
Генен пистолет
• Клетъчна полулация, Технически невзискателна трансфекция
• Невъзможност за контрол на концентрацията и мястото на
въвеждане, Частици остават в клетката
Електропорация на отделна
клетка
Прави мембраната пропусклива
за екстрацелуларни молекули
• Клетъчна популация или отделна клетка
• Невъзможност за контрол на концентрацията, полу-сложна
трасфекционна постановка
Фотопорация (лазерна аблация)
Прогаря дупка в мембраната и
позволява дифузия вещества
Laser
По-широка пипета
с ДНК разтвор
• Определена клетка, отличен контрол на позициониране, елиминира
физични сонди
• Невъзможност за контрол на концентрацията, технически трудна
трансфекция, дифузия на екстрацелуларни вещества в клетката
Иглоподобни наносонди – наносондите днес са толкова тънки, че
преминават през канали на клетъчната мембрабна и не е необходимо
нейното перфориране
• Определена отделна клетка, отличен контрол на позициониране
• Ограничен контрол на концентрацията, технически трудна
трансфекция, труно производство на сондата,
Наноскалпел с прикачен към него клетъчен органел
Микроинжекции на разтвор – най-често използвана техника за
прилагане върху отделна клетка трансфекция
Submicron Diameter
EXTRACELLULAR
Цилиндричен наноканал
Fluid inside
INTRACELLULAR
Cell Membrane
Наноканал
свързан с поширока сонда
• Определена отделна клетка, отличен контрол на позициониране,
бързо контролиращо въвеждане, лесни за производство сонди,
• Технически трудна трансфекция
Стъклена микропипета – далеч по-дебела от наноинжекцията
Submicron Diameter
Предимства
Недостатъци :
• Широкоизползвана,
• Платформа за модерна
клетъчна физиология
•Относително лесна за
извършване
•Относително ниска цена
•
•
•
•
•
Само една функция
Чуплива
Голяма за нанохирургия
Инвазивна
Може да причини
непоправими увреди на
клетъчната мембрана
EXTRACELLULAR
Cylindrical Nanochannel
INTRACELLULAR
Fluid inside
Cell Membrane
Nanochannel
connected to
larger probe
P1
Pinjection
Flow
D
Flow
L
P1 > P 2
P2
Правят възможно
създаването на
наноинжекции
Carbon
Nanotubes
Карбонови
нанотръбички(CNTs)
Single Wall
(SWCNT)
Multi Wall
(MWCNT)
Карбонови нанотръбички
SWCNT – Диаметър от 0.6 до 1.8 nm,
дължина от 20 nm до 500 mm, висока
издръжливост, електрическа и топлинна
проводимост
MWCNT - диаметър >0.6 nm, дължина от
20 nm дo 500+ mm, висока издръжливост,
електрическа и топлинна проводимост
MWCNT
10 nm
Карбонови нанотръбички
• Аморфен въглерод, но може да бъде
закален и да се превърне в графит


Електроосмоза– придвижване на
течности под действието на
приложено електрическо поле
Поток под налягане – придвижване
на течности под действието на
градиента на налягането (>50nm)
Narishige Piston Injector
• Буталото контролира
налягането и обема
Eppendorf Femtojet Injector
• Налягането е зададено
и пулсионно на
оперделено време се
подава обем
• Способност от 6000
hPa
Съчетани наносонди
Магнитно-зависими наносонди
AFM наносонди
• Инжекционен комплекс – съчетание от стъклена наносонда с прикачена
въглеродна нанотръбичка.
Комбинирани нанотръбички
от въглерод в стъклени
нанопипети + електрод
Carbon Tip
5 μm
Quartz Micropipette
Electrical
Connection
Quartz Exterior
Inner
Carbon Film
1 cm
Exposed
Carbon Tip
•
Два микросглобени силиконови компонента
▫ Микро рамка и стойка
▫ Острие във формата на енлонгирана пирамида
•
Микроманипулатора държи стойката докато се правят
разрезите.
•
•
1mm2 рамка
Централно разположено острие.
20µm
100nm
200µm
•
Обстойно тестван:
▫ Високо ефективен при прерязване
аксони
( миелинирани и немилиенирани)
▫ Осигурява рязане без изкривяване
съседни сегменти и избягва механично
срязване
▫ Изпробван ин виво за справяне с въпроса
за това дали миниатюрни режещи
инструменти могат да бъдат ефективни
при реални хирургически условия.
•
Здравина
▫ Демонстрирана чрез повтарящо
намаляване на аксони от седалищния
нерв на мишка.
•
Прецизност
▫ Насочено отстраняване на сегмент от
аксон с малка дължина
25 µm
Нанохирургия върху неврон
Scale = 200 µm


Роботи се използват
в хирургията в наши
дни
Те са по-прецизни,
правят по-малки
разрези, което води
до по-бързо
въстановяване


Болници=клиники
за инжекции
Самолекуване?
Молекулен модел
на задвижащ
механизъм за
нанороботи.
Изграден е от
силикон с
включени серни
молекули, като
всеки девет кутии
се закрепят за
въглеродна.

Нанороботизкуствен фагоцит,
наричан
‘‘microbivores’’,
може да
“патролира с
кръвообръщението
, търсейки и
“изяждайки”
нежелани
патогени.
Благодаря за
вниманието