Transcript Лазерна микродисекция

Лазерната микродисекция- безценният
инструмент на молекулярната патология
и диагностика, съдебната медицина и
съвременната наука
Център по молекулна медицина
Нова биомедицинска революция
Предизвикателството пред патологията е да
интегрира клиничните, морфологичните и
молекулярните измерения на заболяванията
От молекулярната биология до патологията и
медицината: важността на тъканните биологични
проби





Тъканите показват морфолигичната природа на
заболяването
Откриването и характеризирането на молекулните
механизми на заболяването
Валидиране на нови потенциални биомаркери
Архив
Предизвикателство:
събирането
на
проби,
етичност,
процесиране
(стабилност
на
биомолекулите), комплексност
.....................тъканите са комплексни
В близост до тумора има разнообразни
клетъчни субпопулации
Защо тъкани?

Култивирани клетъчни линии

Предимства: самореплициращи се, дават добър добив
ДНК, РНК и белтъци

Недостатъци: отнема време да се създадат, скъпо е, не
винаги е успешно създаването им. Въпреки че
клетъчните линии носят генетичните промени в
тумора, от който произлизат, допълнителни промени
възникват по време на последователните пасажи или
само
определени
туморни
клетки
(например
агресивни) се размножават. Генната експресия в
култивираните клетки може да е много различна от
тази на тумора, защото те вече не са под контрола на
тъканни елементи
Защо тъкани?


Ксенографтно обогатяване на клетъчните
култури- същите ограничения
Техники за сортиране на клетки- плътностни
градиенти,
флуоресцентно
активирано
клетъчно сортиране, антитяло-белязани
имуно частички и афинитетно-белязани
магнитни частички. Необходимо е обаче да
се направи суспензия от клетки.
Развитието на микродисекцията

Микродисекция е била използвана много
преди изобретяването на LM (лазерна
микродисекция)
Lowry
and
Passonneauизползвали
лиофилизирани тъканни срези
 Goelz et al- използвали парафинови блокчета

Недостатъци на ръчните методи
на микродисекция





Изисква се голяма сръчност
Въздушните течения могат да доведат до загуба на
микродисектирания материал при преноса от
пипета или много тънко типче в центрофужна
епруветка
Риск от контаминация
Трудност в изолирането на дифузно разположени
клетки
Времеемки
В опит да се подобри ръчното изолиране било въведено използването на
тиксо, което да покрива избраната за микродисектиране област от въздушни
течения и тремор на ръката на оператора
Развитието на лазерната
микродисекция (LM)

Meier-Ruge et al- 1976, инициират развитието на LM
като използват примитивна UV лазерна технология,
която заема голямо пространство, но постигат
микродисекция на клетъчни субпопулации от
хетерогенни тъкани по-точно от всички ръчни методи

Shibata- 1993- UV лъч, който да разрушава ДНК на
нежеланите компоненти от тъканта (Selective ablation of
unwanted regions)

Emmert-Buck et al- 1996 в NIH- Arcturus Engineering
LM разкрива нови възможности








Молекулярни анализи
Онкология/ Патология
Изследване на единични клетки
Цитогенетка
Живи клетки от клетъчни култири
Изследвания на мозъка
Криминология
Ембриология
LCM на определена
хипоталамусна област
Видове LM



IR LCM- инфрачервеният лазерен пулс води до
локално топене на EVA полимер, адхезиране на
клетките към стопената мембрана. При охлаждане
мембраната отново се втърдява и клетките се
отделят от нея
UV LM-фотоизпарение на нежеланата тъкан,
обграждаща желаната област чрез много тесен
лазерен лъч
Комбиниращи IR и UV- Arcturus Veritas и Acturus
XT
Принцип на IR-LCM
Преди LCM
След LCM
LCM филм
Апарати осъществяващи IR LCM

Arcturus/MDS, Inc
PixCell II
 AutoPix

Arcturus PixCell II
Arcturus AutoPix
UV LM
UV базирани системи за LM



Laser Microdissection (LMD/Leica)
Cut and catapulting system (PALM/Zeiss)
Mmi-CellCut (MMI AG)
LMD/Leica
PALM/Zeiss
Mmi-CellCut
(MMI AG)
Смесен тип LM

Съчетават UV и IR в един апарат:
Arcturus Veritas
 Acturus XT

Arcturus Veritas
Acturus XT
Алтернатива на лазерната микродисекция:
Eppendorf PPMD microdissector
По- евтин, но с по-ниска
прецизност и точност
Характеристики на най-често използваните
техники за микродисекция
Технология
Laser-capture
microdissection
Laser-pressure
catapulting
Ultrasonic piezo power
microdissection
Източник на
енергия
IR лазер
UV лазер
Ултразвук
Принцип
Термично
активиращ се филм,
образуващ комплекс
с тъканта
UV лазерът реже
около таргетната
тъканфотоизпарение
Ултразвук
инициирано движение
на метален тип по
таргетната тъкан
Минимален
размер
7.5 µm
0.5 µm, 1 µm
1.5 µm
Микроскопски
стъкла
Незаредени,
обикновени
Обикновени и
такива с мембрана*
Няма данни
Видове проби
FFPE, замразени
тъкани, цитологични
препарати, живи
клетки
FFPE, замразени
тъкани,
цитологични
препарати, живи
клетки, органели
FFPE, замразени
тъкани, цитологични
препарати, трудни
тъкани
Влияние върху
биомолекулите
Няма влияние. Има
минимално
нагряване
Нагряването може
да има ефект, но
температ. промени
са временни
Няма данни
Видове проби и изисквания към
пробите

Чрез LM могат да се микродисектират отделни
клетки, клетъчни области, хромозоми или дори
части от хромозоми
Видове проби и изисквания към
пробите



Чрез LM могат да се микродисектират отделни
клетки, клетъчни области, хромозоми или дори
части от хромозоми
Пробите могат да са FFPE, замразени тъкани и
цитологични препарати
Факторите въздействащи на интегритета на
биомолекулите са: начин и тип съхранение на
пробите,
времето
за
съхранение
преди
микродисекцията, метода за фиксация и метода на
микродисекция
Очакван добив след лазерна
микродисекция


1 клетка = 6-7 pg
геномна ДНК
1 клетка = 10-30 pg
тотална РНК




80-85% rRNA
15-20% tRNA, snRNA
1-5% mRNA
Белтъчното
съдържание зависи от
типа органи и от
степента на белтъчна
деградация
rRNA
tRNA, snRNA, miRNA
mRNA
Предимства на лазерната
микродисекция






Бързина (особено UV LM), прецизност, гъвкавост и
възможност за документиране на експериментите
Избягват се сложните стъпки, осъществявани от
оператора
Не разрушава съседни тъкани
Могат да се изолират клетки разпръснати сред
други клетъчни популации
Приложение в молекулната генетична диагностика
При UV системите за разлика от IR системите няма
контакт с тъканта, няма риск от контаминация
Ограничения на лазерната микродисекция

Намалена оптична резолюция на оцветените и
дехидратирани тъканни срези поради липсата на
предметно стъкло

Трудности при прецизното микродисектиране на
комплексни тъкани с ограничени архитектурни
характеристики (лимфоидни неоплазии, дифузно
инфилтрирани карциноми).


Специални багрила или имунохистохимично оцветяване
Използване на дифюзер
Ограничения на лазерната микродисекция

При contact-lift off метода често има затруднения в
събирането на избраните клетки от препарата, което
може да се дължи на здраво прикрепяне на тъканта към
положително заредено предметно стъкло или на
остатъчна влага останала в тъканта

При FFPE препаратите наличие на повреди в ДНК,
РНК и белтъците => ограничения в PCR базираните
методи за изследване- трябва да се амплифицират къси
ампликони

IR LCM не са добри за дисектиране от срези по-тънки
от 10µm
Предизвикателства пред LM

Всички микродисекционни системи са микроскоп
базирани:



Процесивност


Оператор-зависими
Хистопатологично обучение е необходимо
Събирането на голям брой клетки за някои видове
анализи понякога е невъзможно
Не винаги са подходящи за много малки мишени

Отделни клетки или разпръснати клетки, субклетъчна
микродисекция
Източници на
биологичен материал
Хирургични срези
Замразени
В парафин
Цитологични препарати
ИХХ
оцветени
FISH
Touch
Prep
Смир
Клетъчен
блок
Стабилизиране на пробите
Подготовка на микроскопските препарати
LM
Изолиране
Анализи
Thin
Prep
Cyto
Spin
Приложения на LM
ДНК базирани анализи
 РНК базирани анализи
 Протеин базирани анализи
 микроРНК базирна анализи

Откриване на нови биомаркери
Диагноза
Прогноза
Таргетна терапия
Генетични
мутации
Микрочипове
Епигенетични
промени
aCGH
LOH
ДНК базирани
Анализи
Цялостна
геномна
амплификация
X- хормозомно
инактивиране
Primer extension
preamplification
RFLP
SSCP
ДНК базирани анализи

LOH
ДНК базирани изследвания- LOH


LOH анализите при изследване на рак се използва за
картиране на туморсупресорни гени и за изучаване
честотата на промяна на определени туморсупресори
при различни видове тумори
LOH за анализ на клоналността:



Анализ на клоналността на мултифокалните тумори
Клонален анализ на първичните и метастазиралите
тумори
Клонален
анализ
на
прогениторни
клетки
в
мултикомпонентни тумори
ДНК базирани изследвания- клонален анализ на
X свързаното алелспецифично хиперметилиране


Клетките получени от една прогениторна
клетка имат инактивиране на една съща Х
хромозома
За доказване на клонална неопластична
трансформация
РНК базирани анализи



Изследване на експресионен профил
Серийни анализи на генната експресия
Микрочипове
Протеомика





Western Blot
2D-PAGE
Зимограми
Обратно фазови чипове
Мас спектроскопски техники
Примери за приложението на LM
Възникване на рака на стомаха
Изолиране на inner cell mass cells
(белите стрелки)
Трофектодермални клетки (черни
стрелки)
LCM на ендосперм
LCM на крио срези на глобуларната фаза на Arabidopsis
embryo
LCM за изучаването на молекулните
промени при меланома
Простатна
тъкан преди
LCM
Простатна
тъкан преди
LCM
LCM туморен
епител
LCM
нормален
епител
LCM тумор
асоциирана
строма
LCM
нормална
строма
Приложението на LM в криминалистиката

STR анализите- основен метод за ДНК
базирана идентификация
Повечето следи съдържат клетки от повече от
един източник => изолиране на ДНК от повече
от един индивид -> микс от генотипи и трудно
интерпретиране на резултатите
 Често клетките на жертвата са много повече от
клетките на извършителя


Трудно интерпретиращи се резултати:
Ниска ДНК концентрация
 ДНК деградация
 Присъстивие на инхибитори


Изход- LM
Недостатъци на разработените методи за
разделяне на сперматозоиди от други
клетки

Диференциален лизис метод- за разделяне на
спермата от епителните клетки


Получават се две фракции (ДНК от извършителя
и ДНК от жертвата), но разделянето НЕ винаги е
пълно
У- хромозомен STR анализ

У хромизомите са идентични при всички
роднини по бащина линия
Недостатъци на разработените методи за
разделяне на сперматозоиди от други клетки

Филтрационен метод



70% от сперматозоидите преминават през филтъра, а
епителните клетки остават на повърхността
1-2% от епителните клетки също успяват да преминат
през филтъра
Флуоресцентно активарано клетъчно сортиране

Прилага се единствено за вагинални лаважи. НЕ може да
се прилага за вагинални натривки или архивен материал,
нито за разделяне в тъканни препарати
Недостатъци на разработените методи за
разделяне на сперматозоиди от други клетки

Магнетично активирано клетъчно сортиране



Трудно се открива моноклонално антитяло специфично
свързващо антиген на повърхността на сперматозоидите
Антитен стабилен в деградирали съдебни проби
Микро изфабрикувано устройство за разделяне на
сперматозоиди от епителни клетки на Horsman et
al- базира се на различни физични свойства на
клетките

Само 25% от сперматозоидите се възстановяват (остават
интактни)
Всички тези методи са неефикасни при
сепарацията, при използването на минимално
количество материал или невъзможност за
използването на архивен материал
За да се направи пълен ДНК профил са
необходими 15-20 интактни сперматозоида, които
могат да бъдат осигурени чрез LM.
Разработващи се методи

Изолиране и на други мъжки клетки- добра
алтернатива при азооспермените
извършители


Полово специфично белязане на келтки за LCMFISH- У хромозомни специфични проби
Изолиране на женски клетки (от кондоми)

Белязана на Х и У хромозомите с различни
флуоресцентни багрила
Приложения на LM в криминалистиката



Събиране на фоликули от косми с цел по-ефикасно
изолиране на ДНК без контаминиращи вещества
(инхибитори като кератин)
Изолиране на кръвни клетки от различни клетъчни
смеси- например от кръв и слюнка
LCM за получаване на ДНК профили от
биологични проби, когато са смесени с отломки,
замърсители, прах, мръсотия

Изолиране на клетки от букална лигавица смесени с
почва
Приложения на LM в криминалистиката

Отделяне на клетки
от
лепенки,
използвани
за
събиранее на улики
от коли, трупове и др.

Бъдещето на LM- Expression
Microdissection (xMD), Automated Cell
Recognition
Имуно-базирана
микродисекционна
технология за бърза, специфична и полуавтоматична тъканна микродисекция

Не е необходима микроскопска
идентификация на таргетните клетки




Срезите са ИХХ белязани. Препарата се покрива
с термочувствителен филм, следва облъчване на
цялото и поле и накрая филмът се отделя със
захванатите таргетни клетки
Процесират се около 50 000 клетки за
секунда
Елиминират се трудностите при селекцията
на таргетни клетки поради не добрата
картина
Оператор- независима система
Благодаря за вниманието !