Transcript 抗生素的质量分析与研究
抗生素的质量分析 与研究 上海市食品药品检验所 刘浩 目录 • • • • • • • • 抗生素（微生物药物）的定义和组成 抗生素结构的特点 抗生素质量的宏观分析 抗生素质量的微观分析 抗生素质量的常规分析 抗生素质量的综合分析 抗生素质量分析的分类介绍 抗生素质量分析的展望 抗生素（微生物药物）的定义和组成 • 抗生素（antibiotic）（1944年）：微生物在其代 谢过程中所产生的具有抑制其他种类微生物生长 及活动甚至杀灭其他种类微生物的化学物质 • 1950s：抗菌素；青霉素类，链霉素类，四环素类 • 1980s：在低微浓度下有选择地抑制或影响其他种 类生物机能并在微生物生命过程中产生的具有生 理活性的次级代谢产物及其衍生物。抗肿瘤类； 抗寄生虫类；磺胺类，酮康唑类；芬净类，磷霉 素类，氯霉素类，单环类（氨曲南）和碳青霉烯 类（硫霉素） 抗生素（微生物药物）的定义和组成 • 1990s：微生物药物（microbial medicine）：由微生物在其生 命活动过程中产生的在低微浓度下具有生理活性的次级代谢产 物及其衍生物 • 具有抗微生物感染、抗肿瘤和抗病毒作用的传统抗生素 • 具有调节原核生物和真核生物生长和复制等生理功能的免疫调 节剂、受体拮抗剂或激动剂、抗氧化剂、特异性酶抑制剂如部 分他汀类调节血脂药：洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、美伐 他汀 抗生素结构的特点 • 纯度一般较化学药品低：同系物多、异构体多、多组分、 多晶型、降解产物多 • 发酵工艺中可变性较大，可控性较低：生产菌种不同，代 谢产物差异，活性组分易发生变异，提取工艺不同 • 活性组分易发生变异，稳定性一般较化学药品差：分子结 构中通常含有较活泼的化学结构，该结构为抗生素的活性 基团并易受外界环境的影响而发生变化 • 杂质谱复杂且难以预测 抗生素的耐药和研发 • “限抗令”：50种（三级），35种（二级）；细菌 耐药“模式”的改变和“加剧” • 2011.4.7：WHO“世界卫生日”主题：细菌耐药性 • 2001—2011：FDA：3/12；达托霉素（脂肽类） 、 瑞他帕林（截短侧耳素类）、菲达霉素（新型 大环类） • 近30个候选药物：针对多药耐药革兰阴性菌者少 • 抗菌药的生命周期短，利润低，研发难度大 • 抗生素的研发：国外：受市场驱动，仅GSK和 AstraZeneca；国内： “十一五”、“十二五”——“ 抗耐药菌创新药物研发”专题 抗生素质量的宏观分析 • 利用各种分离分析手段对各种抗生素的纯度（主要活性成 分及其有关组分）进行全面剖析，以达到对它们的本质有 一个宏观的了解 • 通过对纯度和组分的控制防止由于生产菌种和生产工艺的 不同照成品种的混淆或假冒现象的发生 抗生素质量的宏观分析 • 去甲万古霉素，万古霉素：NMR鉴别 • 万古霉素B：BP/ChP：≥93.0%；USP：≥85.0% • 制霉素：制霉菌素A3+多真菌素B+制霉菌素A1；效价和稳 定性均较高 • 制霉菌素：制霉菌素A1 • HPLC、UV、IR、NMR、MS 抗生素质量的微观分析——杂质分析 • 杂质的定义：任何影响药物纯度的物质。药物中所含有的 没有治疗作用、可能影响药物的稳定性和疗效，甚至是对 人体健康有害的物质 • 杂质研究的内容：具体工艺及产品特点，杂质的来源及结 构；合适的分析方法；综合药学、药理毒理及临床研究结 果，确定合理的杂质限度 抗生素质量的常规分析 • 利用生物学、物理学、药理学和化学等相关学科的经典的 或现代的技术和方法按照指定的质量标准进行依法检验 • 性状、鉴别、检查和含量测定 • 性状：粉末的颜色；晶型：氨曲南、利福平等 • 鉴别：红外鉴别：多晶型，转晶；手性构型的鉴别；成盐 的酸根的鉴别（阿奇霉素盐的种类的选择）；TLC法和 HPLC法 抗生素质量的常规分析 • 熔点：多组分，熔距宽；红霉素转晶；氯霉素 • 比旋度：组分控制：红霉素A（-78˚），红霉素C（-65˚～-62˚）， ChP：-78˚～-71˚；手性异构体纯度的控制：磷霉素：异构体无抗菌 活性；磺苄西林：D(－)构型的抗菌活性为L(＋)构型的抗菌活性的4 ～8倍（不同厂家产品的异构体比例不同） 抗生素质量的常规分析 • 水分或干燥失重：游离水，结晶水 • 头孢噻肟钠：ChP：6.0%，国外药典：3.0% • 水活度的分析结合加速稳定性实验：水分含量低于3.0% 时，可以基本消除水分对头孢噻肟钠稳定性的影响 • 酸碱度（临床、稳定性、澄清度） 抗生素质量的常规分析 • 溶液的澄清度：酸中不溶性物质（头孢噻肟钠）；胶塞等包 材中的释放物与药物的相互作用 • 溶液的颜色：分离方法不能检出的有色杂质（头孢呋辛钠、 头孢曲松等） • 炽灼残渣和重金属：无机杂质；铜和锌可促使β-内酰胺开环 • 杂质吸光度：盐酸多西环素（490nm）：检查有色蛋白类杂 质、异构体和降解物；两性霉素A 抗生素质量的常规分析 • 抽针试验：苄星青霉素（青霉素的二苄基乙二胺盐）：混 悬液，5号针头（防止临床使用时针头被堵塞） • 晶体的形状及其粒径与临床用药安全相关：肌注后由于颗 粒太大引起局部组织红肿等刺激性反应 • 针头堵塞的原因：晶粒的形状、大小、分布不匀、晶粒之 间的静电引力和凝聚等 • 制备过程中应避免形成针状结晶，以粉碎至平均粒径约为 150μm的板状结晶为佳 残留溶剂 ICH：按照对人体和环境的危害程度分为四 类并制定了限度标准 中国药典：在几乎所有抗生素原料药项下均 按其生产工艺制定残留溶剂检查 工艺不同，溶媒不同，同一品种可能有几十 种溶媒；以类别为单元，涵盖同类药品可 能涉及的有机溶剂；ChP采用同一色谱条 件 顶空进样：标准加入法排除基质干扰 β-内酰胺类抗生素中2-乙基己酸的测定 加2-乙基己酸钠（或碳酸氢钠或醋酸钠）成盐、结晶 对人体和环境有潜在的毒害性 头孢噻吩钠、头孢呋辛钠、苯唑西林钠等 GC法：13种人用β-内酰胺类抗生素和2种β-内酰胺酶抑制 剂；限度规定为0.3%～0.8% • 33%盐酸溶液溶解，环己烷提取，上层环己烷溶液进样分 析 • 有些品种的样品不能完全溶解 • • • • β-内酰胺类抗生素中β-萘酚的测定 • 头孢菌素可选择性的与β-萘酚络合并从水溶液中沉淀出来 （头孢菌素极少受到降解）；滤过分离；混悬液酸化，去 络合，有机溶剂萃取；结晶 • 产品中β-萘酚的残留量差异较大 • 每天的允许摄入量为2mg/day，如成人每天服用抗生素的 最高剂量为4g，则β-萘酚的最大残留量应低于100 ppm • ChP的HPLC法：头孢克洛、头孢拉定、头孢氨苄、头孢 羟氨苄等 抗生素质量的常规分析 • 异常毒性：非药品本身引起的毒性反应；反映不同来源产品 的质量差异 • USP1990不再收录 • 热原或细菌内毒素：剂量；假阳性和假阴性 • 细菌内毒素检查的假阳性问题： 普通鲎试剂与内毒素的反 应是非特异性的，其凝集系统中存在着G因子反应旁路，一 些非内毒素物质可能含有可以活化鲎试剂G因子的成分，从 而激活鲎试剂凝集系统中的G因子反应旁路而发生凝集反应 ，导致细菌内毒素检查的假阳性 抗生素质量的常规分析 • 有关物质 • 溶出度：与药物生物利用度之间并无绝对的关系；制剂质 量控制的一种手段；反映不同产品主药的晶型、粒度处方 组成、辅料品种和性质以及制剂工艺的差异 • 不溶性微粒和可见异物：光阻法：50μm以下微粒 • 降压物质 • 无菌：微孔滤膜法；青霉素酶灭活法 抗生素质量的常规分析 • 装量差异、片重差异等：可以在一定程度上反映生产工艺 的成熟性 • 含量测定：微生物检定法和理化测定法 • 阿奇霉素片：含量分布呈明显正态分布，含量均值为96 ％；采用微生物检定法的结果较HPLC法的结果约高为5 ％ • 微生物检定法：利用抗生素对细菌的杀死或抑制程度作为 指标来衡量抗生素的效力 • 管碟法和比浊法 抗生素质量的常规分析 理化测定法： 滴定法（酸碱、氧化还原、电位） 紫外光或荧光吸收法 HPLC-UV法、HPLC-ELSD法（ChP氨基糖苷类） 、 HPLC-柱后衍生化-UV法（异帕米星）、HPLC-ECD法（ BP氨基糖苷类、USP阿奇霉素） • GC法（BP大观霉素， BP灰黄霉素， USP克林霉素棕榈 酸酯） • • • • 抗生素中的致敏性杂质 • β-内酰胺类抗生素过敏反应的研究：致敏性高分子杂质 • 外源性杂质：蛋白、多肽、多糖等，或抗生素和蛋白、多 肽、多糖等的结合物。如青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽等 • 内源性杂质：抗生素的自身聚合产物，即抗生素寡聚物和 多聚物的总称 凝胶色谱系统的应用 • Sephadex G10凝胶色谱系统：色谱柱效低、分离效果差 • 不能有效分离不同聚合度的聚合物，易受开环物等小分子杂 质的干扰 • 受制剂中辅料的干扰 • 常用的β-内酰胺酶抑制剂与聚合物同时洗脱 • 无法应用于水溶性差的β-内酰胺酯 • 不能分离碳青霉烯类中的聚合物 高效凝胶色谱系统的应用 • 高效Superdex Piptide（葡聚糖交联琼脂糖）凝胶色谱系统 • 阿莫西林片中不同聚合度的聚合物 • 美罗培南中聚合物 • 青霉素V钾颗粒中聚合物 • 高效TSK 2000SWXL（亲水性多孔硅胶）凝胶色谱系统 • ChP:头孢地嗪钠 高效凝胶色谱系统的应用 • 高效TSK2500 PWXL（乙烯共聚物）凝胶色谱系统 • 阿莫两林钠／克拉维酸钾片中阿莫西林聚合物的分析 • 高效TSK Gel G2500 HXL（苯乙烯-二乙烯苯共聚物）疏 水凝胶色谱系统 • 盐酸头孢卡品酯（cefcapene prvoxil hydrochloride） 中的聚合物 • 头孢泊肟酯中的聚合物 高效液相色谱系统 • 指针性杂质：阿莫西林钠、氨苄西林钠 • 阿莫西林/克拉维酸钾制剂：阿莫西林闭环二聚体为最 大杂质且与杂质总量呈一定的相关性 • 在溶液中，阿莫西林闭环二聚体和二酮哌嗪阿莫西林 的含量与各类阿莫西林聚合物含量之和呈一定的相关 性 生产工艺对氨苄西林钠质量的影响 • 生产工艺：溶媒结晶法（杂质水平低，稳定性高）、冷冻 干燥法和喷雾干燥法 • 闭环二聚体杂质：含量与变化与产品的生产工艺有关 • 溶媒结晶工艺：闭环二聚体含量低且随放置时间的增加增 长缓慢 • 冷冻干燥工艺：闭环二聚体含量高且随放置时间的增加增 长迅速 水活度的概念 • 固体中水分子的存在形式可分为自由水和结合水；只有自 由水参与各类物理或化学反应；其含量是影响样品稳定性 的主要因素 • 水活度（water activity）：反映的是固体中水与各种非水 成分缔合的强度，是样品中所含有的自由水的度量值；反 映了样品中直接参与物理化学反应的自由水的含量 氨苄西林钠产品的开环二聚体含量 与水活度的关系 • 开环二聚体：含量随着样品水活度的增加而增加并在溶媒 结晶工艺产品中较高 • 溶媒结晶的产品：具有较高的自由水含量，易发生水解反 应；水活度较大，水解反应易于发生，产生开环二聚体 • 冷冻干燥的产品：水活度低，不易产生开环二聚体 • 样品中开环二聚体的含量可以间接反映其水活度的大小 盐酸头孢吡肟中N-甲基吡咯烷的检测 • 具有中度急性毒性和明显的致畸变性 • BP、USP、JP：非抑制型IC，磺酸基键合硅胶为填充剂 • ChP：tITP-CZE和非抑制型IC（羧基键合硅胶为填充剂 ） • IC：须配制含头孢吡肟和NMP的混合溶液进样分析以便 确认供试品溶液色谱图中的NMP+峰 盐酸头孢吡肟中 N-甲基吡咯烷的IC检测 • 供试品溶液色谱图中NMP + 峰的保留时间较其在NMP对 照品溶液色谱图中缩短约10% • 供试品溶液进样后，大量强保留的荷正电离子占据了部分 阳离子交换功能基 • 固定相在保留强保留的荷正电离子的同时释放了等摩尔量 的氢离子，后者对弱保留的荷正电离子起到一种微梯度洗 脱的作用 盐酸头孢吡肟中 N-甲基吡咯烷的tITP-CZE检测 • 前导离子：高浓度的探针离子（咪唑） • 终结离子：质子化的头孢比肟和氢离子；质子化 的精氨酸 • 在毛细管前端构建tITP体系：样品自身堆积效应 富积NMP + ，可大体积进样并避免区带的展宽 • 操作缓冲液的pH值（4.7）：处于4~7的安全区间 ；避免CZE过程中被测组分区带的变形以及氢离 子作为同离子对检测灵敏度的降低 • 检测限和定量限：分别相当于头孢比肟量的 0.003%和0.01% MEKC和HPLC检测头孢噻吩钠的杂质谱 • 某些品牌填料的色谱柱：头孢噻吩峰前端未知杂 质峰(ChP对照品)（杂质A） • 化学药物杂质研究的技术指导原则：各种分离系 统均具有一定的局限性，应注意不同原理的分离 系统间的相互补充与验证 • HPLC与TLC、HPLC与CE、反相HPLC与正相 HPLC、反相HPLC与HILIC等 • 各国药典：TLC或GC • 还原型谷胱甘肽：CE(EP/BP) MEKC电 泳图 O S ONa O O O N N S H H H O CH3 Offline-2D-HPLC-CE 庆大霉素 庆大霉素的RP-IP-HPLC-PED图谱 庆大霉素的RP-IP-HPLC-ELSD图谱 Analysis of underivatized gentamicin by CE-UV detection 庆大霉素的precapillary-derivatizationMEKC图 庆大霉素的EMMA-CZE图（左）和 precapillary-derivatization-CZE图（右） 卡那霉素的 EMMA-CZE图 （上）和 precapillaryderivatizationCZE图（下） 卡那霉 素的 CZEC4D电 泳图 磷霉素：1969年自弗氏链霉菌中发现 磷霉素氨丁三醇的HPLC图 Intens x1 6 . b 2.5 0 2.0 d 1.5 fosfomycin e 1.0 c 0.5 a 0.0 0 2 EIC 137 -All 4 EIC 155 -All 6 8 EIC 200 -All 10 EIC 258 -All 12 14 EIC 275 -All 16 Time EIC 396 -All 以山梨酸为探针试剂的tITP-CZE-间接UV 法检测淌度小于磷霉素的杂质 DAD1 C, Sig=235,4 Ref=off (LIUHAO\00000005.D) DAD1 C, Sig=235,4 Ref=off (LIUHAO\00000009.D) DAD1 C, Sig=235,4 Ref=off (LIUHAO\00000012.D) Norm. -5 -10 -15 -20 -25 -30 -35 -40 9 9.5 10 10.5 11 11.5 12 min 以邻苯二甲酸为探针试剂的CZE-间 接UV法检测淌度大于磷霉素的杂质 DAD1 A, Sig=225,4 Ref=off (LIUHAO\00000499.D) DAD1 A, Sig=225,4 Ref=off (LIUHAO\00000500.D) Norm. 150 100 50 0 -50 -100 -150 -200 8 10 12 14 16 18 min 复方药物各成分之间的相互作用 • 利福霉素类复方药物：异烟肼利福霉素腙 制剂辅料与药物的相容性研究 • 乳糖：半缩醛羟基——醛式，可与含有伯胺类结构的化合 物发生缩和反应，生成腙与糖脎等衍生物 • 利福霉素类复方药物：异烟肼与乳糖 胶塞与抗生素的相容性研究 • • • • • 注射用抗生素粉针剂溶液的澄清度 五水头孢唑林钠/头孢唑林钠水合物 无定形头孢唑林钠：不溶于水的复合物 瓶间差异，接触时间，大规格 胶塞：材质（覆膜胶塞：四氟乙烯、聚乙烯或聚丙烯，溴 化丁基胶塞）；硅油（压盖时的滑动性，跳塞）残留量； 清洗方式、水温、水质 注射用头孢拉定致血尿不良反应的 药理学研究 • 结论：大剂量（高浓度）药物会在肾脏中积聚形成结晶， 对肾脏产生一定的化学毒性和物理性损伤；低剂量时，大 量不溶性微粒可能引发血尿不良反应；日龄较小的动物更 易引发血尿不良反应 • 浓度越高，不溶性微粒数目就越多 • 药品的溶解方式——宜振荡溶解 抗生素质量分析的展望 • 质量源于设计（QbD）的理念：产品的特性和生产工艺参 数均是为达到特定的治疗目标科学设计的，而不是对其经 验数据的简单总结 • 根据先进工艺的特点理性地确定工艺异常时各项指标的的 限度，并据此阻止采用落后生产工艺的产品上市 抗生素质量分析的展望 • 杂质检查：对不同来源的杂质设定不同的限度，控制起始 原料的质量、合成工艺的优劣和生产过程 • 特定杂质：如安全性没有进行过评估，其限度均按通则的 要求（ICH）确定 • 仅从安全性的角度考虑杂质的限度：不考虑生产工艺 对微量杂质组分的毒性评价 • 对一些专属性不强，灵敏度不高的动物实验，如小鼠异常 毒性试验、溶血试验、刺激试验、过敏试验、降压试验等 ，通常不宜作为杂质毒性评价的动物模型 • 药物毒性功能基团的理念：从2009年起，利用斑马鱼胚胎 毒性实验评价药物杂质相对于活性成分的相对毒性 实施杂质谱控制的基本策略 对微量杂质组分的毒性快速评价 • 加替沙星光降解杂质、头孢噻肟钠诸杂质、利福平诸杂质 、阿奇霉素杂质J • 利用斑马鱼评价氨基糖苷类抗生素耳毒性的模型（药学学 报，2011, 46: 928） • 斑马鱼胚胎毒性实验与定量结构性质/活性相关 (QSPR/QSAR)分析方法的结合：药品中微量杂质的危险 性评估，确定药品杂质的质控限度（中国药事，2011，25 ：710） 抗生素多晶型与抗菌活性的关系 • 晶型：溶解度；溶液中的构象：NMR，拉曼光谱 • 哌拉西林、头孢噻肟、头孢曲松(2011年严重病例报告数排名第一；过敏 性休克374例，严重过敏样反应241例，27例死亡病；2012.12：注射用头 孢曲松钠安全性问题企业沟通会) • 大环内酯类（阿奇霉素） • 林可霉素 • 氨基糖苷类（阿米卡星：注射液：USP/BP：pH3.5－5.5，ChP：pH4.0 －7.0；生物效价差异显著；辅料；溶液中构象的选择） • 某些化学全合成药物：溶液中的稳定性 抗生素与核糖体的联结 • 大部分抗生素（利奈唑胺、红霉素、氯霉素和四环素等） 通过作用于细菌核糖体而发挥抗菌活性 • 高分辨率细菌核糖体X-射线晶体技术和生物大分子NMR 技术 • 研究核糖体-抗生素复合物的结构（2009年诺贝尔化学奖 ）：可从分子水平上理解抗生素的作用机制、构效关系和 耐药机制，指导设计新的抗生素 多谢！