Transcript Slayt 1

WNT SIGNALING IN BONE METABOLISM
J Boner Miner Metab (2009) 27: 265-271 DOI 10.1007/s00774-009-0064-8
*Takuo Kubota *Toshimi Michigami *Keiichi Ozono
GİRİŞ


Kemik kitlesi, tepe noktasına ulaşmak için kemik
yapımının kemik yıkımını aştığı büyüme dönemi
süresince artar. Yaşamın ileriki dönemlerinde
kemik yıkımının yapımını aştığı süreçte
osteoporoz genel bir sağlık problemi haline gelir.
Kemik kuvvetindeki kişisel farklılıklara genetik
faktörler katkı sağlar.
giriş

İnsan Düşük Dansiteli Lipoprotein Reseptör
Bağlantılı Protein 5 (LRP5) genindeki fonksiyon
kaybı ve kazancının sırasıyla Osteoporosispseudoglioma sendrom (OPPG) ve Yüksek kemik
kitlesi (HBM) fenotipi ile bağlantılı olduğu
gösterilmiştir. Bu bulgular Wnt sinyalinin kemik
metabolizmasındaki rolüne ışık tutar. Çünkü LRP5
Wnt sinyalinin ko-reseptörüdür.
Wnt Sinyali
Salgılanmış Sistein-zengin glikoproteinler olan
Wnt proteinleri en az üç farklı yolla aktive olur:
1. Doğal (β-catenin bağımlı)
2. Ca*²
3. Planar polarite
Bu üç yoldan Doğal yol en iyi anlaşılmış olanıdır.

Doğal Wnt Sinyal Yolağının Şeması
Dickkopfs (Dkks), Secreted frizzled-related
proteins (Sfrps) ve Sclerostin (SOST geni ürünü)
salgılanmış Wnt inhibitörleridir.
Doğal Wnt Sinyal Yolağının Şeması
Wnt sinyalinin eksikliğinde β-catenin, glycogen
sentaz kinaz 3β (GSK3β) ile fosforile edilerek
proteozomal degradasyonu başlatır.
Doğal Wnt Sinyal Yolağının Şeması
Hücre yüzeyinde Wnt sinyali, Frizzled ve LRP5/6
ile üçlü kompleks şeklinde bağlandığında GSK3β
inhibe, β-catenin stabilize olur.
Doğal Wnt Sinyal Yolağının Şeması
Sonrasında β-catenin çekirdekte birikir ve lenfoid
geliştirici faktör (LEF)/ T-hücre faktörü (TCF)aracılı gen transkripsyonunu aktive eder.
Wnt sinyali




Wnt sinyali için diğer bir koreseptör olan LRP5 de
LRP6 gibi tek geçişli transmembran proteinidir.
Bunlar hücre dışında 4 adet YWTD β propeller
(pervane) alandan oluşur. Bu yapılar Wnt
sinyalinde ko-reseptör olarak işlev görür.
Endoplazmik Retikulumdaki bir şaperon proteini
olan Mesoderm Development (Mesd) in hücre
yüzeyindeki LRP5/6 trafiği için gerekli olduğu rapor
edilmiştir.
Doğal Wnt sinyali sadece embriyo gelişiminde
değil, aynı zamanda yetişkin dokuların korunması
ve hastalıkların artışı bakımından da önemlidir.
LRP5


LRP5 Geninin fonksiyon kaybına neden olan
mutasyonlar nadir görülen OR bir bozukluk olan,
erken osteoporoz ve körlük ile karakterize OPPG
ye neden olur. Bu hastalarda kemik kitlesi
azalması ve iskelet frajilitesi görülür.
OPPG ye zıt olarak LRP5 genindeki fonksiyon
artış mutasyonları OD olan HBM fenotipi ile
bağlantılıdır.
Lrp5


Yakın zamanda yayınlanan büyük bir genom
çalışması ve geniş çaplı analizi, bize LRP5
varyantlarının kemik mineral dansitesi ve kırık riski
ile bağlantılı olduğu göstermişti. LRP5 eksikliği
mutasyonları olan farelerde insan kemik fenotipleri
kopyalandı ve HBM fenotipinde LRP5^G17IV
olarak korunduğu ifade edildi.
LRP5¯ ́¯ olan farelerde düşük kemik kitlesi ve
azalmış osteoblast proliferasyonu ile fonksiyonu
gösterildi.
Lrp5



Aşırı üretilmiş LRP5^G17IV proteini olan fare
osteoblastlarında artmış fonksiyon ve azalmış
apopitozise bağlı olarak kemik hacmi ve kuvveti de
artmıştı.
Mutant tip LRP5 aşırı üretimi kemik hacminin aşırı
derecede artmasına olanak verir.
İnsan ve fareler üzerinde yapılan bu çalışmalar
LRP5 in osteoblast proliferasyonu,
differansiasyonu, fonksiyonu ve apopitozisi
üzerinden düzenleme yaparak osteogenez
üzerinde kritik bir role sahip olduğunu gösterdi.
Lrp5


LRP5¯ ́¯ olan farelerde intermittan PTH ya yanıt
olarak kemik formasyonu artar. Böylelikle LRP5 in
PTH ya bağlı kemik metabolizmasında gerekli
olmadığı görüldü.
PTH/Protein Kinaz A sinyalinin GSK3β yı inaktive
ederek Doğal Wnt yolağını aktive ettiği
gösterilmişti. İşte bu yol PTH nın anabolik
yolaklarından biridir.
Lrp5


LRP5¯ ́¯ farelerde ulna’nın mekanik yüklenmeye
bağlı osteogenik cevabı mutant tip farelerin
osteogenik cevabına göre azalmış bulundu. Doğal
Wnt sinyalindeki hedef genler canlıda tibia
yüklenmesinden sonra geliştirildi.
Bu sonuçlar kemikte mekanik yüklenmeye LRP5 in
aracılık ettiğini göstermiştir.
Lrp5


LRP5 hipermorfik ve hipomorfik mutant proteinleri
fonksiyonel olarak incelendi. Hipermorfik
LRP5^G17IV HBM mutasyonunun plazma
membranına hedeflenmenin azalmasına ve Mesd
ile etkileşiminin bozulmasına neden olduğu
bildirildi.
Ne var ki; diğer gruplar, ilk YWTD alanında
kümelenme mutasyonuna uğrayan LRP5 HBM
proteinlerinin plazma membranına ulaşımını
sağladığını, Dkk1 ve sclerostin yoluyla inhibe
olarak Wnt sinyali gelişimine affinitesinin azaldığını
göstermiştir.
Lrp5

Diğer yandan OPPG ye sokulan LRP5 in bazı
missense mutasyonlarındaki hipomorfizmin, Doğal
Wnt sinyal transdüksiyonu azalmasını ve hücre
yüzey bozulmasını başlattığı, her ne kadar
tamamen aydınlatılmasa da, rapor edildi.
LRP6


LRP6 eksik olan mutant farelerdeki komposit
defektlerin Wnt1, Wnt3a ve Wnt7a’yı içeren çeşitli
Wnt genlerindeki mutasyonlardan kaynaklandığı
ve perinatal dönemde ölüme sebep olduğu
gösterilmişti.
LRP6 eksik allellerdeki heterozigositenin kemik
mineral yoğunluğunu LRP5 eksik farelere oranla
daha fazla azalttığı rapor edildi.
Lrp6


Önceden belirlediğimiz bir nokta mutasyonu olan
ringelschwanz (rs), LRP6 geninde spontan
missense mutasyonu olan farelerde somitogenes
defektine, ossifikasyon merkezlerinin ortaya
çıkmasında gecikmeye ve yetişkin kemik kitlesinin
azalmasına neden oldu.
LRP6^rs/rs farelerde azalmış trabeküler kemik
kitlesi ile birlikte genişlemiş erode yüzey gösterildi.
Lrp6



LRP6^rs/rs farelerde üriner deoksipridinolin atılımı
daha yüksek iken serum osteokalsin seviyeleri
mutant tip ikiz eşleri ile karşılaştırılabilir
seviyedeydi.
LRP6^rs/rs osteoblastlarda belirgin bir
proliferasyon, mineralizason ve diferansiyasyon
defekti gösterilemedi.
Reseptör aktivatör nükleer faktör-κ B ligand
(Rankl) ifadesi in vivo ve in vitro incelemelerde
LRP6^rs/rs osteoblastlarda geliştirilir ve
osteoklastogenez ile kemik yıkım aktivitesi
hızlandırılır.
Lrp6



LRP6 aşırı üretimi aynı zamanda Rankl ürünlerini
baskılarken, LRP6^rs mutant proteini baskılamaz.
Benzer şekilde 7-kb RANKL promoter aktivitesi
β-catenin aşırı üretimi ile azaltılır.
Bununla birlikte; LRP6 aracılı sinyal, postnatal
kemik kitlesini kontrol ederken bir parça da kemik
rezorpsiyonunu ayarlar.
İnsanlarda yapılan bir çalışmada LRP6 geni
mutasyonu sonucu osteoporoz ile erken koroner
hastalık, hiperlipidemi, hipertansiyon ve diabet
birlikteliği görüldü.
Lrp6


LRP6^rs mutantları üzerinde yapılan fonksiyonel
analizler LRP6 için bir şaperon olan Mesd
etkileşiminin azalması ile, Wnt/β sinyalinin hasarını
başlattığını ve plazma membran hedeflenmesini
azalttığını açığa çıkardı.
Mesd etkileşimi LRP6 fonksiyonu için olduğu gibi
LRP5 fonksiyonu için de kritik bir öneme sahiptir.
Mesd, LRP5/6’nın hipomorfik mutasyonlarında
terapotik hedef molekül olabilir.
WNT


Wnt metabolizmasında görevi tamamen
açıklanamamış 19 üye vardır. Osteoblastlar,
Kondrositler, Myositler ve Adipositler mezenşimal
kök hücrelerden köken alır. Adipogenezis, diğer
hücrelere dönüşüm sinyali ile uyarılmayan
mezenşimal kök hücrelerinde gelişir.
Wnt1 ve Wnt10b periadipositlerin adipogenezisini
inhibe eder.
Wnt


Wnt7b, Wnt10b ve Wnt5a içeren bazı Wnt’ler
farelerde kemik hemostazında fonksiyon gösterir.
Wnt7b, osteoblastlarda kodlanır ve osteoblast
diferansiyasyonu ile ifade edilir.
Wnt7b’nin kaldırılması, Dermo-Cre kullanan fare
iskelet progenitör hücrelerinde kondrogenez ve
osteoblastogenez defekti ile sonuçlanır. Wnt7b’nin
Gα q11-protein kinaz Cδ yolağıyla (Doğal Wnt
sinyal yolağı aracılığıyla değil) osteoblast
diferansiyasyonuna neden olduğu gösterildi.
Wnt



Transgenik Wnt10b fareler Adiposit-spesifik
FABP4 promoterini kullanarak kemik kitlesini
yükseltir ve yağ dokusunu azaltır.
Wnt10b, osteoblastik proliferasonuna
osteoblastogenik transkripsiyon faktörleri olan
Runx2 ve Osterix’i indükleyip; adipogenik
transkripsiyon faktörleri olan CCAAT/ enhancer
binding protein α (C/EBPα) ve Peroxisome
proliferator-activated receptor γ ( PPARγ) yı
baskılayarak etki eder.
Osterix, doğal wnt sinyalini inhibe eder. Farelerde
osteokalsin promoterini kullanarak Wnt10b aşırı
üretimi yapılması osteoblastogenezi stimüle
ederek kemik kitlesini arttırır.
Wnt


Wnt10b¯ ́¯ farelerde kemik formasyonu
azalmasıyla trabeküler kemik azalır. Bu sonuçlar
Wnt7b ve Wnt10b’nin kemik formasyonunun
endojen regulatörleri olduğunu gösterir.
Wnt5a* ́¯ farelerde kemik iliği mezenkimal
progenitörlerinde gelişmiş adipogenez ve azalmış
osteoblastogeneze bağlı olarak kemik kitlesi
azalır. Wnt5a, kalsiyum/calmodulin bağımlı protein
kinaz ІІ yoluyla, PPARγ transaktivasyonunu histon
metiltransferaz aracılığı ile kromatin inaktivasyonu
yaparak baskılar.
SFRP

Sfrp’ler de Wnt’ler ile Frizzled reseptörler
arasındaki etkileşimi önleyen Wnt antagonistleridir.
Sfrp1¯ ́¯ yetişkin fareler trabeküler kemik artışı
gösterir. Sfrp1 delesyonu in vivo çalışmalarda
osteoblast apopitozisini inhibe ederken, in vitro
düzeyde osteoklastogenezi arttırır.
DKK




Dkk’lar salgılanmış glikoproteinlerdir. Dkk1, Dkk2
ve Dkk4; LRP5 ve LRP6 ile etkileşimdedir.
Wnt/β-catenin sinyalini inhibe eder. Dkk1¯ ́¯ fareler
hatalı baş indüksiyonu nedeniyle ölür.
Dkk1* ́¯ fareler kemik rezorpsiyonunu
değiştirmeden kemik formasyon artışı ile HBM
fenotipi gösterir.
Fare osteoblastlarında aşırı üretilmiş Dkk1,
azalmış osteoblast sayısı ve kemik formasyonuna
bağlı osteopeni gelişimine neden olur.
Dkk


Dkk1 antisense oligonükleotid tedavisi,
overyektominin mineral dansitesi üzerindeki
baskılayıcı etkisini ve femurlardaki yükün tepe
noktasına ulaşmasını önler. Osteoblast sayısını
arttırır. Rankl üretimini baskılayarak osteoklast
diferansiyasyonunu bozar.
Dkk1, kemik formasyonuna negatif etkide bulunur
ve osteoklastogeneze indirekt yolla etki eder.
Dkk


Beklenmedik şekilde, Dkk2¯ ́¯ fareler artmış
osteoid yapı ve azalmış mineralizasyon nedeniyle
osteopeniktir. Bunlar; Rankl üretiminin arttırılması
ile gelişen osteoklastogenez nedeniyledir.
Böylece Dkk2 nin kemik formasyon ve
rezorpsiyonuna etkili olduğu görülür. Doku
analizleri ve mutagenez çalışmaları fare
Dkk2’lerinin C-terminal sistein zengin alanlarının
üçüncü LRP5/6 β propeller alanları ile bağlantılı
olduğunu göstermiştir.
SCLEROSTİN


Sclerostin, SOST geni tarafından kodlanıp
salgılanan Wnt antagonistidir. Birçok çalışmada
sclerostinin LRP5 ve LRP6 ya bağlanıp
Wnt/β-catenin sinyalini ve kemik morfogenetik
proteini (BMP) yolağını inhibe ettiği gösterilmiştir.
LRP5^G17IV mutasyonu, sclerostin-LRP5
bağlantısını iptal edip sclerostin ile inhibisyona
direnç sağlayarak HBM fenotipine yatkınlık
gösterir.
Sclerostin


İnsanda fonksiyon kaybı mutasyonları ve SOST
geni ürünlerinin azalması sırasıyla Sclerosteozis
ve Von Buchem hastalığı ile birlikte anılır.
Farelerde SOST geni aşırı üretimi kemik kitlesi ve
formasyonunda sırasıyla artış ve azalmaya neden
olur.
Sclerostinin osteositlerde açıklanamayan bir
şekilde kemik remodelingi ve mekanik yük algısı
kaynaşmasını sağladığı öne sürülmüştür. Böylece,
Sclerosin’in umut vaat eden terapotik hedef
molekül olduğu söylenebilir.
Sclerostin




Sclerostin monoklonal antibody’ler postmenopozal
kadınlarda kemik formasyon işaretçilerini geliştirir
ve arttırır.
Mekanik stimülasyon ve PTH tedavisi sclerostin
üretimini azaltıp endojen wnt inhibisyonunu
hafifleterek kemik formasyonunu arttırabilir.
Transgenik fare osteositlerinde aktif PTH
reseptörü kemik kitlesi ve remodelingi arttırır.
LRP5 delesyonu HBM fenotipini azaltır. Fakat
transgen nedenli kemik remodelingini arttırmaz.
Osteositlerde PTH reseptör sinyali LRP5 bağımlı
ve bağımsız mekanizmalarla kemik
metabolizmasına etki eder.
GSK3β




GSK3β, β-catenin ile birlikte birçok substratı
hedefleyen bir serin/treonin kinazdır.
Bir GSK3β inhibitörü olan Lityum, farelerde kemik
kitlesi ve formasyonunu arttırır.
Şaşırtıcı bir şekilde bir vaka kontrol çalışmasında
Lityum tedavisi insanlarda azalmış kemik kırığı
riski ile birlikte anılmıştır.
GSK3β* ́¯ farelerde gelişen Runx2 transkripsiyonel
aktivitesine bağlı olarak kemik formasyon artışı
gösterilmiştir.
β-CATENİN



β-Catenin, osteoblast gelişiminin çeşitli evrelerinde
farklı roller oynar.
Dermo1-Cre fareler ve Prx1-Cre farelerin kondrosit
ve osteoblastlarının mezenkimal
prekürsörlerindeki β-catenin delesyonu osteoblast
diferansiyasyonunu bloke eder.
İntramembranöz ve enkondral kemikleşme
boyunca kondrositlerde ektopik kemik
formasyonuna neden olur.
β-catenin


Böylece β-Catenin’in osteoblast formasyonunun
erken evrelerinde gerekli olduğu görülmüştür.
Olgun osteoblastlarda β-Catenin başka önemli
fonksiyonlarda da rol oynar.
α1(1)collage-Cre fare osteoblastlarında β-Catenin
inaktivasyonu kemik rezorpsiyonunu arttırıp
osteoproteogerin (opg) üretimini geliştirerek kemik
kitlesinde azalma başlatır.
β-catenin


Ek olarak Osteocalsin-Cre farelerde β-Catenin
kaybı osteoklast artışı ile şiddetli osteopeniye
neden olmuştur. Doku incelemelerinde β-Catenin
eksik osteoblastlarda artmış Rankl üretimi ve
azalmış Opg üretimi görülmüştür.
Bu bulgular, olgun osteoblastlarda β-Catenin’in
osteoklastogenez ve osteoklast fonksiyonunu
ayarladığını gösterir.
TCF




Tcf’ler, Wnt/β-Catenin sinyaline aracılık eden
transkripsiyon faktörleridir.
Tcf1¯ ́¯ farelerde düşük kemik kitlesi görülür. Bu
mutant farelerde osteoblast sayısı ve fonksiyonu
değişmezken osteoklast sayısı ve opg üretimi
artmıştır.
Bu bulgular diğer spesifik β-catenin eksik fare
osteoblastlarındaki bulgularla benzerdir.
Oysa bir başka çalışmada; doku Runx2 geninin
TCF bağlanma alanından doğal Wnt sinyal
yolağını direkt olarak hedef aldığı gösterilmiştir.
ÖZET


Canlılar üzerinde yapılan çalışmalardaki çeşitlilikle
LRP5 genindeki mutasyonların bulunması Wnt
sinyalinin kemik metabolizmasındaki rolünü
anlamamızı sağlamıştır.
Osteoblastlardaki Lrp6-aracılı sinyal
osteoklastogenezi düzenleyebilir. Ne var ki;
Osteoklastlardaki Doğal Wnt sinyalinin rolü tam
olarak açıklanamamıştır. Doğal olmayan Wnt
sinyalinin kemik metabolizmasındaki rolünü
anlamada da bilgilerimiz kifayetsizdir.
Doğal Wnt Sinyalinin Osteoblast
Diferansiyasyonundaki Rolü
Doğal Wnt sinyali mezenkimal progenitör
hücrelerinin osteoblastlara dönüşümünü arttırırken
kondrosit ve adiposit diferansiyasyonunu inhibe
eder.
Doğal Wnt Sinyalinin Osteoblast
Diferansiyasyonundaki Rolü
Osteoblastlarda, Wnt yolağı OPG/ RANKL oranını
arttırarak apopitozis ve osteoklastogenezisi bloke
ederken proliferasyon ve mineralizasyonu arttırır.
Doğal Wnt Sinyalinin Osteoblast
Diferansiyasyonundaki Rolü
Sclerostin, osteositlerde üretilen, osteoblast
proliferasyonunu ve fonksiyonunu baskılayan bir
doğal wnt sinyali inhibitörüdür.
Özet


Farmakolojik açıdan, diğer dokularda
tumörigenisite ve doku toksisitesi önemli
olmasına rağmen Wnt sinyal yolağında birçok
basamak terapotik hedef olarak dikkate alınabilir.
Plasma membranındaki LRP5/6 miktarını
arttırmada Mesd hedef moleküllerden biri olabilir.
Sclerostin, osteositlerde bilinmeyen bir şekilde
kodlandığı için, sclerostin oluşumunun önlenmesi
en umut verici tedavi yöntemidir.
Teşekkürler..